Способ получения оптически активных производных цис-7-амино-1-азабицикло-(4,2,0)-окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты Советский патент 1983 года по МПК C07D471/04 

Изобретение относится к получению новых производных t4ttcr-7-aMHHO -1-азабицикло(4,2,0)-окт-2-ен-8-он -2-карбоновой кислоты общей формул 2 (100Н где R. - водород или С -С -алйил R - водород или хлор, атомы водорода в положении б и 7 находятся в «4г« -конфигурации, которые обладают высокой биологиче кой активностью и могут найти прим нение в медицине. Известны карбацефемные соединен имеющие различные заместители в по жении 3, 4 и 5 С 1, Однако эти соединения получают синтетическим методом с использованием оптически неактивных исходн соединений. Цель изобретения - разработка н вого способа получения неописанных соединений, обладающих ценными фар кологическими свойствами, Поставленная цель достигается . согласно способу получения оптичес ки активных соединений общей форму лы,. Нг1Гу 1 ,L. где R - водород-или . -алкил RJ - водород или хлор, атомы водорода в положении б и 7 находятся в ti-ыс-конфигурации, заключающемуся в том, что соединен общей формулы ом я-сн-С-N ,, где R - фения или оксифенил; X - водород или аминогруппа; R и Ib- имеют указанные значения подвергают взаимодействию с энзимом способным к оптически селективной реакции деацилирования и получаемым из микроорганизмов, принадлежащих к роду Aefomonas, Achromobacte г, Asthr-obacte г, Acetobacter, Alcaligjenes, Escherichia, Xanthoironas, Kluyveia, Gluconobacter, Clost -idia Comamonsis, Corynebactevium, Sarcina Staphylococcus, Streptomyces, Spitilluir, Nocardia, Bacillus, PseudomonaSj MavobactefiuiP, Brevibacterium, fV otaminobacte r, Proteus, Beneckea, Micrococcus, Micoplana, и Rhodopseudomonds-. Указанный энзим используют в ви- де раствора очищенного энзима, клеточного тела, извлекаемого из питательной среды клеточной суспензии, суспензии разорванных клеток, бесклеточного экстракта или питательной среды микроорганизмов. Полученные оптически активные соединения обладают сильной противомикробной активностью ацильныхсоединений по сравнению с соответствуницим оптически неактивным в1-соединением. Эти соединения являются особенно пригодными в качестве промежуточных веществ при получении оптически активных ацилированных соединений, которые являются сильными противомикробными агентами. Пример. 1-1. Получение разрушенной клеточной суспензии. а Культивирование микроорганизма обладающего способностью к стереоселективному деацилированйю. В качестве посевного штамма использу$от Kluyvera citrophila. В качестве посевной среды испольг з,уют водный раствор, содержащий,%: полипептон . 1 дрожжевой экстракт J, мясной экстракт 0,5; глутамат натрия 0,5 и хлористый натрий 0,25 доведенный до значения рН 7,0 с помощью 5 н. раствора NaOH. Нетлю с посевным штаммом инокулируют в 10 мл посев- ной среды и большой пробирке емкостью 50 МП, культивирование проводят при в течение 24 ч. Весь посевной бульон инокулируют в 300 мл культуральной среды в холбе Эрленмейера . емкостью 2 л и при и встряхивании проводят культивирование. Состав основной культуральной идентичен аналогичному для посевной среды. б) Получение разрушенной клеточной суспензии. После культивирования в течение 24 ч культуральный бульон подвергают центрифугированию с целью получения клеточных тел. Клетки промывают дважды 50 мл 0,9%-ного соле вого раствора и суспендируют в 1/ЗОМ фосфатном буферном растворе до концентрации 40 мг сухого веса в 1 мл. Затем 10 мл клеточной суспензии вводят в большую пробирку на 50 мл и подвергают ее ультразвуковому измельчению в течение 2 мин при 200 В для того, чтобы получить разрушенную клеточную суспензию. При этой обработке используют льтразвуковой дезинтегратор модель R200P. 1-2. Получение раствора с /бстраа. На этой стадии 200 мг (+) -фенилацетамидо-1-азабицикло Г4 ,2,0) .окт-2-ен-8-он-карбоновой кислоты ( термин Ц-ис относится к стереохим в положениях б и 7, то же самое ис пользуют в последующем), Добавляют 9 мл 1/ЗОМ-фосфатного буфера (рН 6 Поскольку это соединение не раство ряется, небольшими порциями добавляют 2 н, раствор NaOH и снова доводят рН раствора до 6,5 для того чтобы растворить это соединение. Окончательно добавляют деионизированную воду, получая 10 мл раствора 1-3. Энзимная реакция. На этой стадии 10 мл упомянутой разрушенной клеточной суспензии добавляют к 10 мп раствора субстрат и проводят энзимную реакцию при 30 в течение 80 мин. Протекание реакции во времени показано в табл. 1. Таблица Как видно из табл. 1, реакция и выход становятся стационарными после того, как степень превращения смеси оптически активных изомеров достигнет 50% (молярное отношение 1-4. Выделение и очистка целевого соединения. После завершения реакции клетки удаляют центрифугированием реакционной смеси. Надосадочную жидкость подкисляют до рН 3,0 с помощью 2н. раствора соляной кислоты и подают в колонку (2,6 см ширина, 51 см высота, заполненную 270 мл смолы JSfiano НР-10. Элюирование проводят деионизированной водой и элюат собирают в виде 5 мл фракций. Целевое соединение элюировалось во фракции от 280 до 315 мл. Эти фракхщи концентрируют при пониженном давлении, лиоФилизуют и раст воряют в небольшом количестве смеси воды и метанола I 50:50 по объему Раствор податбт в колонку 1,6 см ширина, 64,5 .см высота), заполненную. 130 мл смолы Сефадекс LH-20. Элюирование проводят смесью метанола и воды (50:50). Элюат собирают в виде 5 мл фракций. Фракции от 65 до 85 мп объединяют и концентрируют при пониженном давлении для того, чтобы удалить метанол. Затем лиофилизуют остаток, получая 48 мг белого порошка. Свойства продукта следующие. Поглощение в ИК-спектре (KBh), длакс, см- :1800, 1790, 1775, 1640, 1620. ЯМР-спектр (100М DjO-DSS) м.д.: 6,46 {1Н, Дублеты, I 3,5 и 4,7 Гц) 4,88 UH, д. I 5,2 Гц); 4,06 11Н, мультиплет) , 2,5-1,5 {4Н, м). Обнаружено, что это соединение содержит один моль хлористого водорода и воды. Свойства этого соея««ения хорошо согласуются с соответствующими б 1-соединениями..,:. Величина оптического вращения составляет Ы + (,5, в 1М растворе фосфатного буфера fpH 7,0)) , эта величина хорошо согласуется со значениемС з;3 5 48,5 (,5, в 1М растворе, фосфатного буфера (рН 7,0}) , приведенным в примере 2. Это соединение дает единственное пятно положительного нингидрина при величине Rf 0,22 на тонкослойной хроматографической силикагелевой пластине, растворитель для проявления - изопропанол:уксусная кислота: вода 4:1:1. Значение Rf совпадает с таковым для оптически неактивного d1-соединения. П р и м е р 2. Получение (+)Syusf -7-амино-1-азабицикло(4,2,0) -окт-2-ен-8-он-2-«арбоновой кислоты (альтернативный метод). 2-1. Получение разрушенной клеточной суспензии по Ме.тодике примера 1-1. 2-2. Получение раствора субстрата. На этой стадии lOQi мг (+)-14tte-7- (R)-2-фенил-2-аминоацетамидо -1-азабицикло С4 ,2,0)-окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты растворякгг в 5 мл 1/30 М фосфатного буферного раствора (.рН 6,5). 2-3. Энзимная реакция. На этой стадии 5 мл разрушенной клеточной суспензии, упомянутой выше, добавляют к 5 мл раствора сувстрата и проводят энзимную реакцию при в течение 24 ч. 2-4. Выделение и очистка. По методике примера 1-4 получажяс 46 мг белого порошка. Свойства этого соединения хорошо совпадают с соединениями, полученными в примере 1. 48,5(,5, в 1К фосфатном буферном растворе, рН 7).

Примерз. Получение (-)-Jjfcr -7 fS-амино-4 csl-мeтил-l-aзaбициклo 4,2,0) окт-2-ен-8-он 2 карбоновой кислоты. ..

I 3-1. Получение разрушенной клеточной суспензии.

Повторяют методику примера 1-1.

3-2. Получение раствора субстрага..

Повторяют методику примера 1-2 с тем исключением, что используют (i)- -7 р -фенилацетамидо-4 oi.-мeтил-l-aзaбициклo(4,2,0) -окт-2-ен-8- -он-2-карбоновую кислоту.

3-3. Энзимная реакция.

Повторяют методику примера 1-3 с тем исключением, что используют полу ченные в разделах 3-1 и 3-2 разрушенную клеточную суспензию и раствор субстрата. Коэффициент реакции становится стационарным через 1ч. Реак цию продолжают в течение 120 мин. Выход (±) субстрата составляет 50% молярное отношение) . , .

3-4. Выделение и очистка целевого соединения.

Повторяют почти полностью методику примера 1-4. По завершении реакции клетки удаляют из реакционной смеси центрифугированием. Жидкость над осадком подают в колонку (2,5.см шириной, 46 см высо|:ой), заполнен- ную 220 мл смолы Диаион НР-10. Элюирование проводят деионизированно водой и злюат собирают в виде 5 мл .фракций. Целевое соединение злюировалось во фракции от 200 до 270 мл. Эти фракции концентрируютпри пониженном Давлении, лиофилизуют и растворяют в небольшом количестве воды

и метанола. С 50; 50) .S Раствор подают на колонку ширина 1,6 см, высота 64,5 см), заполненную 130 мл смолы Сефадекс LH-2P, и Проводят элюирование смесью воды и метанола (50:50). Элюат собирают в 50 мл фракции. Фракции от 65 до 80 мл объединяют и концентрируют, удаляя метанол. Затем лиофилизуют остаток, получая 30,5 мг белого порошка, своЛ ства которого приведены ниже.

ИК-спектр ( КВГ) )Mnv;c 1800 1770 плечо), 1760 (пл.), 1740, . 1680, 1630.

ЯМР-спектр (100М DjtO-DSS) ,м.д.: 6,16 {1Н, Дубл. , I 5,1 Гц;-, 4,52 (1Н, дубл., 1 4,9 ГЦ); 3,86 (1Н, мульт.), 2,64 (1Н, мульт.) 1,9-1,4 2Н, мульт.); 1,10 (ЗН, дубл I 7.3 Гц).

Обнаружено, что это соединение представляет собой калиевую соль, содержащую 2 моля вЬды Свойства : этого соединения хорошо совпадают с соответствующими dP -соединениями. Это соединение дает единственное пятно положительного нингидрина при /

значении Rf 0,33 на тонкослойной хроматографической силикагелевой , пластинке (используют тот же силикагель, что и в примере 1-4). Величина R совпсщает с такой же для оптически неактивного dC -соединения. Оптическое вращение Cci. (,5, в 1м фосфатном буферном растворе). Эта величина хорошо согла.суется с приведенной в примере 4. |t«. -30,8 (,5 в 1М фосфат. ном буферном растворе, рН 7,6), .

П р и м е р 4. Получение ()-t tt0-7 |i -амино-4оС-метил-1-азабицикло- |4,2,0)-окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты Сальтернативный метод ).

4-1. Получение разрушенной клеточ ной суспензии. : .

Повторяют .методику примера 3-1.

4-2. Получение раствора субстрата

(.+ )--tiUC-7- (R)-2-Фeнил-2-aминoaцeтaмидoD-4 оС-метил-1-азабицикло (4,2,0)-окт-2-ен-8-он-2-карбоновую кислоту (100 мг)-растворяют в 50 мл 1/ЗОМ фосфатного буферного раствора (iJH 6,5) .

4-3. Энзимная реакция.

Как и.в примере 1-3, добавляют .5 мл разрушенной клеточной суспензии, описанной выше, к 5 МП раствора субстрата и энзимную реакцию проводят при в течение 24 ч.

4-4. Выделение и очист.ка целевого продукта. .Повторяют методику примера 3-4, получая 55 мг белого порошка. Свойства соединения совпадают с таковыми, указанными в примере 3

Оптическое вращение -30,8 (,5, в 1М фосфатном буферном растворе, рН 7,0). .

П р и м е р 5. Получение (+) Ц((С-7-амино-1-азабицикло(4,2,0)-окт-2-ен-8-6н-2-карбоновой кислоты (альтернативный метод) .

5-1. Культивирование микроорганизмов. .

В качестве среды используют водный раствор, содержащий,: мясной экстракт 1; пептон 1} хлористый натрий 0,3 и дрожжевой экстракт 0,5 подщелачивают его до рИ 7,2 с помощью 5н. раствора NaOH. Петлю с посевным штаммом инокулируют в 30 мп посевной среды в колбе Эрленмейера емкостью 300 мл и проводят культивирование при в течение 24 ч Клеточные тела, полученные центрифугированием .культурального бульона, промывают 5 мл 0., ролевого раствора и снова выделяют из него клетки центрифугированием. Клеткй суспендируют в 1/ЗОМ растворе фосфатного буфера fрН 7,0) в кон- , центрации 20 мг сухого веса в 1 мп.

5-2. получение раствора субстрата

{+)-(itttf-7-(R) - 2-Фенил-2-аминоацетамидоЗ-1-азабицикло(4,2,О -окт-2-ен-8-он-2-1 арбоновую кислоту (150 мг) растворяют в 15 мл 1/ЗОМ раствора фосфатного буфера (рН 7, 5-3. Энзимная реакция. Смешивают по 0,5 мл каждой клеточной суспензии, полученной как в примере 5-1, и 0,5 раствора субстрата и с/лесь подвергают взаим действию при 30°С в течение 20 ч. 5-4. Идентификация продукта. Возможно проведение анализа диастереоизомеров (+)-t$ttC -7-(R)-2-фенил-2-аминоацетамидо11-1-азабицикло(4,2,0)-окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты с помощью высокоскоростной- жидкостной хроматографии В этом примере диастереоизоме количественно определяют,этим мето дом. Количественное определение 7-амино-1-азабицикло(4,2,0)-окт- -2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты, полученной в примере 5-3, возможно по той же методике. В реакционной смеси остается непревращенным более полярный диастереоизомер, т.е. (-) -Ци.Ь- 7- (R) -2-фенил-2-аминоадетамидоО-1-азаби цикло{.4,2,0)-окт-2-ен-8-он-2-карбоновая кислота, а количество мене -полярного изомера, т. е. ( + - ц.иС-7- {К)-2 фенил-2-аминоацетамидоЗ-1-азабицикло(4,2,0)-окт-2-ен-8-он -2-карбоновой кислоты, уменьшается. В соответствии.: с этим уменьшением количества субстрата образуется пик С+ -14ас-7-амино-1-азабицикло С4,2,0)окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты. Расхождение в убыли (Н-)-г$« с-7-С(Я)-2-фенил-2-аминоацетамидоЗ-1-азабицикло (4,2, -окт-2-ен-8-он-2-карбоНовой кислот и образовании ( + )-г№С-7-амино-1-азабицикло Г4 ,2,0 -окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты зависит от наличия f -лактамазы в реакционной системе. П р и м е р б. Получение. (+) -Цй -7-амино-1-азабицикло (4,2 j 0/-окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты .(альтернативный метод. , Микроорганизм Clostvidium aceto hutylicum IFO инокулируют в 100 мл бульона картофельного крахмала (пр ду.кт лаборатории DIFCO) . Воздух в ферменторе вытесняют стерилизованным газообразным азотом и фер ментор закрывают. Культивирование проводят при в течение 48 ч. . После культивирования выделяют клетки, промывают их физиологическим солевым раствором и суспендируют в 2 мл 1/ЗОМ буферного раство ра фосфата калия (рН 7,0). Смешивают 0,5 мл раствора субстрата, полученного как в примере 5-2, и .клеточной суспензии и подвергают их взаимодействию при 30°С в течение 20 ч. За ходом реакции следя как в примере 5-4. Непревращеннбй остается (-) -г;$лс-7-С(Я)-2-фенил-2-аминоацетамидо -1-азабицикло-(4,2,0) -окт-2-ен-8-он-2-карбоновая кислота, уменьшается только количество (+Л- с-7- СЮ 2-фенил-2-аминоацетамидо -1-азабицикло (4,2 ,0)-окт-2-ен -8-он-2-карбоновой кислоты. Убыль этого вещества составляет 1,0 мг, при этом образуется 0,2 мг (+)-7-амино-1-азабицикло 4,2,0 -окт-2-ен-8-:он-2-карбоновой кислоты. П р и м е р 7. Получение (-)- 1«7-7-амино-.3-хлор-1-азабицикло 4,2,0 -окт-2-ен-8-он-2- карбоновой кислотц. : : 7-1. Получение разрушенной клето чнОй суспензии. а) Культивирование микроорганизма, обладающего способностью к стереоселективному .цеацилированию. В качестве посевного штамма используют Kluyvei a. В качестве посевной среды, используют водный раствор, содержащий,%: полипептон 1J дрожжевой экстракт 1; мясной экстракт 0,5J глутамат натрия 0,5 и хлористый натрий 0,25, .который подщелачивают до рН 7,0 н. раствором NaOH. Петлю с посевным штаммом инокулируют в 10 мл посевной среды в большой пробирке емкостью 50 МП и проводят культивирование . при 30°С в течение 24 ч. Весь посевной бульон инокулируют в 300 МП куль туральной среды в колбе Эрленмейера на2 л и проводят культивировдние при 30°С со встряхиванием. Состав основной культуральной средаа такой же, как и состав посевной среды. б) Получение разрушенной клеточной суспензии . После культивирования в течение 24 ч культуральный бульон подвергают центрифу.гированию с цehью получёния клеточных тел. Клетки промывают дважды по 50.мл солевым раствором (0,9% исуспендируют в концентрации 40 мг сухого веса в 1 мп 1/ЗОМ фосфатного буферного раствора(рН 8,0). 7-2. Получение раствора субстрата. На этой, стадии 200 мг f±)-t ttC-7-фенилацетамило-3-хлор-1-азабицикло(4,2,ОХ-окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты, полученной как в примере 7, добавляют к 9 МП 1/ЗОМ раствора фосфатного буфера (рН 8,0. Поскольку это соединение не растворяется, то добавляют небольшими порциями 2н. раствор NaOH и смесь снова доводят до рН 8,0 для того чтобы растворить соединение. Окончательно добавляют деионизированную воду, чтобы получить И) мл раствора 7-3. Энзимная реакция. На этой стадии 10 мл упомянут разрушенной клеточной суспензии добавляют к 10 мл раствора субст та и проводят энзимную реакцию п в течение 80 vmn. Протекание реакции во времени показано в табл. 2. Т а б л и ц Выход (моКоличестПериодво обралярное отн реакции, шение; , % зовавшемингося соединения (1-1), мг/мл 7-4. Выделение и очистка цешевого соединения. После завершения реакции клетки выделяют из реакционного раствора центр1Ифугированием. Жидкость над осадком концентрируют при пониженном давлении, получая 5 мл раствора. Этот раствор подёиот в колонку (ширина 1,75 см, высота 42 см, заполненную смолой JUiaHOH НР-10. Элюирование проводят деионизиро- ванной водой. Целевой продукт элюи руют во фракции от 90 до 12а мл. Эти фракции концентрируют при пониженном давлении, получая 2 мл раствора, который подкисляют до рН 3,5 1н. раствором соляной -кислоты для того, чтобы выпали кристал-, лы. Эти кристаллы выделяют фильтрацией, промывают небольшим количеством метанола и высушивают, получая 38 мг белого порои ка.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ЧиС-1- , -АМИНО-1-АЗАБИ1ШКЛО-( 4,2,0) -ОКТ- 2-ЕН-8-ОН-2-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ общей формулы Л 1 где R - водород или С -Сд-алкил; Rg - водород или хлор, атомы водорода в положении 6 и 7. находятся в Цис -конфигурации, заключсиощййся в том, что соединение общей формулы t X СООН где R - фенил или оксифенил; X - водород или аминогруппа; Rj- имеют указанные значения, подвергают взаимодействию с энзимом, способным к оптически селективной . реакций деацилировання я получаемым. из микроорганизмов, принадлежащих . к роду.:АегЬзпопаз, Achromobacter, ., Arthrobacter, Acetobacter, Alcaligenes, Escher ichia, Xanthonranas, Kluyverai Gluconobacter ClostridiDm, Coraamonas, Conynebacteriom, Sarcina, ,StaphylQcoccus, Stieptomyces, Spi «illum, Nocardia, Bacillus, Pseudononas, FlaVobactei ium, Bvevibacteirium, Pfotaniinobacte r, Pnoteus, B.eneckea, Micrococcus, Micoplana и Rhodopseudojnonas. 2. Способ no П. 1, о т л Ич а ю щ и и с- я тем, что указанный энзим используют в виде раствоiра очищенного энзима, клеточного тела, извлекаемого из питательной среды клеточной суспензии, суспензии разорванных клеток, бесклеточО ного экстракта или питательной сре-ды микроорганизмов. сх Приоритет по признакам: 4 10.02.79 при R - водород или С.-С -алкил; Rj - водород; R - фенил; CD Х- водород или аминогруппа. 14.11.79 при R - водород или C.-Q -алкил; R2. - тводород или хлор; R - фенил или оксифенил; X - водород или аминогруппа.