Способ определения активности @ -лизин- @ -оксидазы Советский патент 1983 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к б Ьрхимни конкретнее к биохимическим способам определения активности ферментов, в частности Ц -лизин-о,-оксидазы и может быть применено в мипробиологии, биохимии, медицине, ферментной медицинской промышленности, для . определения активности L,-лизин-ot-ок сидазы, которая ингибирует рост лей кемических клеток мьши in vitro u in vivo. Известен спектрофотометрический способ определения активности друго оксидазы - диаминооксидазы. Способ основан на взаимодействии образующейся при фер ментативной реакции 2 с О-дианизидингидрохлоридом в присуствии пероксидазы. Способ был использован для определения активно ти диаминооксидазы в тканях животных, l 3. Недостатком способа.является нео ходимость 20-минутной прединкубации проб для определения активности. Кроме того, способ применяется толь ко для определения активности диами нооксидазы в экстрактах тканях животных. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ определения активности L-лизин-о1-оксидазы в культуре гриба рода Trichoderma .включающий культивир вание гриба на пшеничных отрубях, центрифугирование водного экстракта культуры и определение активности в реакционной смеси, содержащие U-лиз водный экстракт культуры и буферную смесь с рН 8,О. Определение проводят следующим образом. Реакционная смесь содержит Ц-лизин и фосфоркислый калий (рН 8,0) в конечных концентрациях соответственно 10 и 70 мкМ, а также 350 ед. каталазы из печени быка и разные количества водного экстракта культуры гриба. Смесь инкубируют аэробно при 37°С 20 мин со встряхиванием. Реакция заканчивается добав лением 0,1 мл 25%-ного ТХУ и проба центрифугируется. После центрифугирования 1 мл чистого супернатанта смешивается с 2 мл 1 М ацетатного буфера рН 5,0 и 0,8 мл 0,1%-ного 3-мет,ил-2-бензртиа золи нон гидрозон-гидрохлоридомсвещеприготовленным. Инкубация проведена при 50°С 30 мин Затем реакционная смесь охлаждается до комнатной температуры, поглощение измеряется против контроля при максимуме поглощения,(316-325 им) на спектрофотометре. Белок определиют по Лоури и за одну единицу активности фермента принято количество фермента, катализирующего образование 1 мкМ d-кето- -аминокапронЬвой о- -ами1 . 2.. кислоты за 1 мин Недостатком известного способа является использование редких и дорогостоящих реактивов; каталазы из бычьей печени, с.-кето- -аминокапроновой кислоты, З-метил-2-бензотиазолинон-гидразонгидрохлорида, а также, многостадийность определения. Цель изобретения - ускорение и удешевление способа определения активности (-лизин-с6-оксидазы. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности ,-лизин-оС-оксидазы в культуре гриба ,рода Trichoderma,, включающему культивирование гриба на пшеничных отрубях, центрифугирование водного экстракта культуры и определение активности в реакционной смеси, содержащей L,-лизин, водный экстракт культуры и буферную смесь с 8,0, определение активности фермента проводят по О,04%-ной перекиси водорода, в состав реакционной смеси вводят 0,04%-ную Пероксидазу. 0,5%-ный 0-дианизидгидрохлорид и 0,05М трис-НС1|в качестве буферной системы, а L,-лизин используют в концентрации 5мкМ при следующем соотношении компонентов, об.%: , 0,05М трис -НС1 15-30. 5 мкМ L, -лизи-н 50-55 О , 04%-ная пероксидаза4-50,5%-ный О-дианизидингидрохлорид 4-5 Водный экстракт культуры12-20Способ заключается в том, что фермент L-лизин-о -оксидазу получгиот путем культивирования штамма Trichoderma sp.B 250 МЛ колбе С 10 Г пшеничных отрубей с 7 мл 11,4%-ного NarJO j, 1.0 МЛ HjO при 14 Дней. Затб:м в колбу добавляют 100 мл Н20, в течение 2 ч культуру встряхиваю па SchuttelaBoarat type 327 (Premd ПНР.) и отжимают через хлопчато бумажную ткань, а водный экстракт центрифугируют от спор и мицелия и определяют активность /.-лизин-й4-оксидазы. Реакционная смесь содержит,об.% на 1 мл: 0,05М Трис-НС 15-30 ЗмкМ U-лизин50-55 0,04%-ная пероксидаза4-50,5%-ный О-дианиэидингидрохлорид 4-5 Водный экстракт культуры12-20Смесь инкубируют аэробно при 37 С 20 мин и охлаждают. Реакцию заканчивают добавлением 1 мл 9,8 и. НС1 и последующим охлаждением проы до комнатной температуры. Оптическую плотность окрашенных астворов измеряют на спектрофотоетре при 540 нм.

Нижняя граница чувствительности метода ± 0,1 нмоль, воспроизводи-. мость ± 0,1 нмоль.

Белок определяют по Лоури. За 1 ед. активности фермента принято количество фермента, катализирую|Щего образование 1 нмоль К 2 за |l мин в стандартных условиях.

.Пример 1. Инкубационная смесь имеет следующий состав,%: 5мкМ U-лизин 55;0,05М трис-НС1 бу,фер, рН 8,0, 15; 0,04%-ная пероксидаза 5 0,5%-ный О-дйанизидингидрохлорид 5-; водный экстракт 20. Смесь инкубировали аэробно при 37 С 20 минут и охлаждали. Реакцию заканчивают добавлением 1 мл 9,8 н. НС1 и последующим охлаждением пробы до комнатной температуры. Оптичекую плотность окрашенного раствора измеряют спекгрофотометрически при 540 нм. Активность фермента в -аообе 2,3 ед. (11,5 ед/мл экстракта

П р и м е р 2. Инкубационная смесь имеет следующий состав,: 5мкМ Ц-лизин 50 , трис -буфер, рН 8,0, 30; О,04%-ная.пероксидаза 4; 0,5%-ный О-дианизингидрохлорид 4, водный экстракт 12. Смесь инкубируют аэробно при 37°С 20 мин и охлаждают. Реакцию заканчивают добавлением 1 мл 9,8 н. НС1 и последующим охлаждением пробы до комнатной температуры. Оптическую плотность

0 окрашенного раствора измеряют спектрофотометрически при 540 нм. Активность фермента в пробе 1,3 ед. (11,67 ед/мл экстракта ).

Предложенный способ исключает ис5пользование дорогостоящих реактивов (каталазы из печени быка и 3-метил-2-бензотиазолинон-гидразонгидрохлорида , того, существенно сокрадает определение активности L-ЛИЗИН-oL-оксидазы (на 30 мин ) за счет отсутствия второй стадии - реакции с З-метил-2-бензотиазолинон-гидразонт-идрохлоридом.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ Ц-ЛИЗИН-о -ОКСИДАЗЫ в культуре гриба рода Trichoderma, включающий культивирование гриба на пшеничных .отрубях, центрифугирование водного экстрата культуры и определение активн ости в реакционной смеси, содержащей Ц-лиэин, водный экстракт культуры и буферную смесь с рН 8,0, о т л и , ю щ и и с я тем, что, с целью ускорения и удешевления способа, определение активности фермента проводят по 0,04%-ной перекиси водорода, в состав реакционной смеси вводят о,04%-нуюпероксидазу, 0,5%-ный 0-дианизидгидрохлорид и 0,05м трис-НС1 в качестве буферной системы, а Ц-лизин используют в концентрации 5 мкМ при следующем соотношении компонентов, об.% 0,05М Трис-НС 15-30 в 5 мкМ L-лизин 50-55 0,04%-ная перок идаза4-5 0,5%-НЫЙ О -дианизидингидрохлорид4-5 Водный экстракт культуры12-20 ;О СП