Способ получения сорбента для иммобилизации биологических активных веществ Советский патент 1983 года по МПК C08B15/06 C08J5/20 C12N11/12 

О

ел

N9 СД

О

со

Изобретение относится к синтетической органической химии, в частности к способу получения сорбентов для иммобилизации биологически активных веществ и может быть использовано в химической промьпиленности для получения биоспецифических сорбентов с целью дальнейшего их использования в биоспецифической хроматографии Новом, эффективном методе, позволяющем выделять большинство биологически активных веществ с высокой степенью очистки, а также в медицине и микробиологии при проведении лабораторных исследований.

Известен способ получения сорбента для иммобилизации биологически активных веществ путем обработки исходной матрицы г1минопроизводных агароэы fi-нитробензоилазидом с последующим восстановлением его нитрогруппы fl .

Недостатком этого способа является использование в нем в качестве матрицы агарозы - дорогостоящего реагента, не выпускаемого отсечественной промышленностью.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения сорбенту для иммобилизации биологически активных веществ путем модификации аминопроизводных простых эфиров целлюлозы сероуглеродом и изобутилхлорформиатом, в результате чего получают сорбенты, содержащие изотиоциа натные группы 2 .

Однако эти группы пригодны лишь для иммобилизации ферментов. Кроме того, в качестве модифицирующих агентов используются высокотоксичные вещества, такие как сероуглерод и изобутилхлорформиат, в результате чего способ не имеет практического значения.

Цель изобретения - создание сорбентов с повышенной сорбционной емкостью по отношению к биологически активным веществам.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения сорбента для иммобилизации биологически активных веществ путем обработки аминопроизводных простых эфиров целлюлозы модифицирующим агентом, аминопройзводные простых эфиров целлюлозы обрабатывают п-нитробензоилазидом при 20-30°С в течение 4-5 ч с последующим восстановлением нитрогруппы дитионитом натрия при 50-60 С в течение 4-5 ч.

После диазотироваиия полученный сорбент сочетается с широкой группой соединений - ароматическими аминами, фенолами и рядом гетероциклических соединений (субстратами, ингиб торами, кофакторами ферментов, белками) .

Лминопроизводные простого эфира целлюлозы, например аминоэтилцеллюлоза, б-аминогексиламид карбоксиметилцеллюлозы или 2-окси-З-(«/-аминогексил) аминопропиловый эфир целлюлоэь, обрабатывают в водном растворе диметилформамиде п -нитробензоилазидом при 20-30С в течение 4-5 ч затем восстанавливают нитрогруппу полученного носителя до аминогруппы дитионитом натрия при 50-60 С в течение 4-5 ч в водной среде, причем каждые 10 г соответствующего эфира целлюлозы обрабатывают 0,525 М раствором а -нитробензоилазидо в водном растворе диметилформамида, а при восстановлении аминогруппы использугт 0,5 К водный раствор дитионита натрия. Выбранные соотношения компонентов реакционной смеси являются оптимальными, их изменение в сторону уменьшения приводит к уменьшению степени замещения, т.е. ухуди ению свойств сорбентов, а.увеличение соотношения компонентов в реакционной смеси не приводит к улучшению свойств конечного продукта и таким образом не является целесообразным.

Последующая иммобилизация биологически активных веществ протекает путем обработки полученного сорбента азотистой кислотой при в течение 0,5 ч с последующим сочетанием биологически активных веществ в течение 1ч.

Пример 1. 50 г аминоэтилцеллюлозы со степенью замещения 0,52;ммоль/г суспендируют в 200 мл смеси, состоящей из 120 млО,2 М боратного буфера рН 9,3 и 80 мл диметилформамида, затем прибавляют раствор 40,32 г (0,21 моль) а-нитробензоилазида в 200 мл диметилформамида и перемешивают при 20С в течение 4 ч. Полупродукт а-нитробензамидоэтилцеллюлозу отфильтровывают, промывают диметилфо1 1амидом, водой и суспендируют в 500 мл 0,5 М раствора дитионита натрия в 0,5 М бикарбонате натрия и перемешивают при в течение 4 ч. Продукт отфильтровывают, промывают водой, диметилформамидом, ацетоном и,сушат на воздухе. Содержание продукта 0,50 ммоль на 1 г сухого сорбента.

В таблице показано влияние параметров синтеза на выход конечного продукта. Загрузка реагентов во всех примерах осуществляется по примеру 1

Пример 7. Используя в качестве .исходного материала б-аминогексиламид карбоксиметилцеллюлозы со степенью замещения 0,30 ммоль/г и проводя синтез, как указано в примере 3, получают продукт со степенью замещения 0,24 ммоль/г.

Пример- 8. Используя в качестве исходного материала 2-окси- 3- ( aMHHcjreiicn;i) iiMHH.npoiinjioHHft . . эфир nenjiK Jio:iij CO сгггшеиью замещения 0,33 ммоль/г и проводя синтез п примеру 3, получают продукт со степенью замещения 0,28 ммоль/г. Возможности использований пЪлуценного сорбента для иммобилизации биологически активных веществ иллюстрируются следующими примерами. Пример 9. Иммобилизация тирамина (субстрат фермента). 10 г t-аминобензамидоэтилцеллюлозы суспендируют в 200 мл 0,5 н соляной кислоты, затем охлаждают до О С и прибавляют холодный раствор 5 г нитрита натрия в 25 мл воды, пере;мешивают при 0С в течение 20 мин, затем быстро отфильтровывают, промы вают холодной 0,01 н соляной кисло той и суспендируют в 250 мл холодного () 0,1 н фосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 8,65 г (0,05 моль) гидрохлорид тирамина I и перемешивают при О С в течение 1 ч. Продукт отфильтровывают, промы вают водой, ацетоном и сушат на воздухе.Содержание продукта 0,45 ммоль/г. I Пример 10. Иммобилизация нуклеозидфосфатов (кофермент) 10 г Л-аминобензамидоэтилцеллюлозы обрабатывают нитритом натрия, как указа но в примеве 9, суспендируют в 250 мл холодного (0°С) 0,1 и фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 3,91 г (0,01 моль) аденозий-5-монофосфорной кислоты динатриевой соли и перемешивают при в течение 1 ч. Продукт отфильтровывают, промы вают водой, ацетоном и сушат на воз духе. Содержание продукта 0,30 ммоль Пример 11. Иммобилизация 3, 4-диметокси-/3-фенилэтиламина (ингибитор фермента) . 10 г п -аминобензамидоэтилцеллюлозы обрабатывают нитритом натрия по примеру 9 и суспендируют в 250 мл холодного () 0,1 н фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 1,81 г (0,01 моль) 3,4-диметокси- -фенилэтиламина и перемешивают при в течение 1 ч.Продукт отфильтровывают, промывают водой, этанолом и сушат на воздухе. Степень превращения, судя по цветному тесту, с тринитробензолсульфонатом натри;я является количественной. Полученные сорбенты обладают повышенной сорбционной емкостью по отношению к биологически активньо1 веществам, содержащей 300-450 мкмоль/г по сравнению с сорбентом по способупрототипу, у которого емкость сое-. тавляет 0,5-5 мкмоль/г. Кроме того, применение новых модифицирующих агентов, обеспечивающих введение с-аминобензоильного остатка, позволяет получить сорбент для иммобилй зации целого, ряда биологически активных веществ, таких как субстраты ферментов, ингибиторы ферментов, коферменты и другие, которые невозможно иммобилизовать сорбентом,полученным по известному способу.При этом сохраняются все преимущества целлюлозного носителя. Применение .новых модифицирующих агентов исключает использование высокотоксичных веществ, таких как сероуглерод и изобутилхлорформиат, являющихся . . в прототипе одними из компонентов реакционной смеби.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ путем обработки аминопроизводных простых эфиров целлюлозы модифицирукяцих агентом, о т л ичающийся тем, что, с целью создания сорбентов с повышенной сорбционной емкостью по отношению к биологически активньин веществам, аминопроизводные простых эфиров целлюлозы обрабатывают в -нитробензоилавидом при 2О-30°С в течение 4-5 ч с последующим восстановлением нитрогруппы дитионитом натрия при 50-60С в течение 4-5 ч.