Способ выделения микросом из ткани желудка экспериментального животного Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области биохимии и может найти применение при изучении монооксигеназной ферментной системы желудка.

Целью изобретения является повышение физиологичности способа за счет сохранения активности цитохрома Р 450 в микросомах.

Цель достигается тем, что животному перед декапитацией вводят через зонд в желудок 2% раствор гидрокарбоната натрия (МаНСОз) из расчета 1 мл на 100 г массы, а извлеченный желудок промывают средой, содержащей 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина, после чего дальнейшую

процедуру выделения микросом проводят по прототипу.

Способ осуществляется следующим образом.

Непосредственно перез забоем животному вводят в желудок через зонд 2% раствор натрия гидрокарбоната из расчета 1 мл на 100 г м&ссы тела. Затем животное забивают декапитацией, быстро извлекают желудок, отсекают пищевод и двенадцатиперстную кишку, в отверстие пищевода шприцем с канюлей вводят среду выделения, содержащую 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина рН 7.8, после чего желудок вскрывают, измельчают ножницами и гомогенизируют в среде выделения, состоящей

из 50 ед/мл контрикала, 3 ед/мл гепарина в 0,05 Мтрис-буфере(20% глицерина в 1,15% KCI) рН 7,8. Затем гомогенат центрифугируют на центрифуге при 9000 g 20 мин, над- осадок повторно центрифугируют при 105000 g 60 мин, полученный осадок микро- сом ресуспензируют в среде, состоящей из 0,05 М трис-буфера (20% глицерин в 1,15% KCI) рН 7,8, после чего спектрофотометриче- ски определяют содержание в микросомах желудка цитохрома Р 450.

П р и м е р 1. Крыса-самец массой 200 г. За 5 мин до декапитации животному в желудок через зонд введено 2 мл 2% раствора натрия гидрокарбоната. После этого крыса декапитирована. Желудок извлечен, отделен от пищевода и 12-перстн0й кишки. В просвет желудка введено 5 мл среды промывания, содержащей 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина. Желудок вскрыт, измель- чен, гомогенизирован вереде, содержащей 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина, путем дифференциального центрифугирования выделена микросомальная фракция, в которой спектрофотометрически опреде- лено содержание цитохрома Р 450, составившее 0,06 нмоль/мг белка, а также активность деметилазы амидопирина и НАДФ-Н цитохром-с-редуктазы, составившие 0,147 нмоль НСОН/мг белка/мин и 12 нмоль/мг белка/мин соответственно.

П р и м е р 2. Кролик-самец массой 4 кг. За 5 мин до декапитации животному в желудок через зонд введено 40 мл 2% раствора натрия гидрокарбоната. После этого кролик декапитирован. Желудок извлечен, отделен от пищевода и 12-перстной кишки. В просвет желудка введено 50 мл среды промывания, содержащей 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина. Далее процедура выделе- ния микросом проведена по примеру 1. Содержание цитохрома Р 450 0,101 нмоль/мг белка, а активность ферментов 0,403 нмоль НСОН/мг/мин и 6,48 нмоль/мг/мин.

П р и м е р 3. Морская свинка-самец 500 г массой. За 5 мин до декапитации животному в желудок через зонд введено 5 мл 2% раствора натрия гидрокарбоната. После этого животное декапитировано. Желудок выделен, в просвет введено 12 мл среды промы- вания, содержащей 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина. Далее процедура выделения микросом проведена по примеру 1. Содержание цитохрома Р 450 0,049 нмоль/мг белка, а активность ферментов 0,314 нмоль НСОН/мг/мин и 5,0 нмоль/мг/мин.

В таблице приведены данные по активности ряд ферментов и содержанию цитохрома Р 450 в желудках крыс, кроликов и морских свинок.

При выделении микросом желудка по прототипу содержание цитохрома Р. 450 не определяется, активность ферментов отсутствует.

Положительный эффект объясняется тем, что благодаря проведению нейтрализации соляной кислоты в желудке перед декапитацией животного и раннему блокированию протеолитических ферментов путем промывания органа до его измельчения и гомогенизации (в отличие от прототипа) средой выделения появляется возможность получить функционально полноценные микросомы желудка, обеспечивающие количественную характеристику цитохрома Р 450 в желудке у животных, что в свою очередь позволяет исследовать монооксигеназную ферментную систему желудка при различных патологических состояниях с целью разработки вопросов патогенеза и оценки эффективности проводимой лекарственной терапии при пероральном приеме лекарств.

Формула изобретения

Способ выделения микросом из ткани желудка экспериментального животного путем декапитации животного, извлечения желудка, его измельчения и гомогенизации в среде выделения, отделения микросом дифференциальным центрифугированием, о т- личающийся тем, что, с целью повышения физиологичности способа, за счет сохранения активности цитохрома Р 450 в микросомах, перед декапитацией животному вводят в желудок раствор гидрокарбоната натрия до нейтрального рН желудка, а перед измельчением желудок промывают средой, содержащей 50 ед/мл контрикала, 3 ед/мл гепарина, 0,05 М трис-буфер, 20%- ный раствор глицерина и 1,15%-ный раствор хлорида калия рН 7,8.

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для выде- ления микросом из ткани желудка животных. Цель изобретения - повышение физиологичности способа за счет сохране- ния активности цитохрома Р450 и моноокси- геназной ферментной системы желудка. Животному непосредственно перед забоем вводят в желудок раствор натрия гидрокарбоната. Затем животное забивают декапи- тацией. Быстро извлекают желудок, отсекают пищевод и 12-перстную кишку. В отверстие пищевода шприцем с канюлей вводят среду выделения, содержащую 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина с рН 7,8. После этого желудок вскрывают, измельчают ножницами и гомогенизируют в среде выделения, состоящей из 50 ед/мл контрикала, 3 ед/мл гепарина в 0,05 М трис(20% глицерин в 1,15% КС)буферес рН 7,8, затем гомогенат центрифугируют на ультрацентрифуге при 9000 g 20 мин , надосадок повторно центрифугируют при 105000д 60 мин. Полученный осадок микросом ресус- пензируют в среде, состоящей из 0,05 М трис(20% глицерин в 1,15% КС)буфера рН 7,8, после чего спектрофотометрически определяют содержание цитохрома Р450 в микросомах желудка. 1 табл. ё