Способ иммобилизации микросом печени Советский патент 1985 года по МПК C12N11/18 

О) ел

сл

СА Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения иммобилизованных микросом печени животных, и может быть применено в медицине и биохимии для изучения метаболизма и ток, сического действия лекарственных веществ, в аналитической промьшшен )ности (для создания ферментных эле ментов) в тонком органическом синтезе (для направленного получения продуктов окисления, обладающих оп тической активностью). .Известен способ иммобилизации микросом печени, заключающийся п ковалентном связьгоаний с матрицей BrCN-активированной сефарозой ПТ. Недостатками данного с.пособа являются необходимость разделения монооксигеназной системы микросом печени на компоненты: цитохром Р-450, НАДФН-зависимую редуктазу и фосфатидилхолин перед иммобилизацией для получения стабильного продукта, обладающего активностью, так как при иммобилизации самой системы микросом наблюдается полное исчезновение монооксигеназной активности, низкая активность и ст бильность целевого продукта. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и дости гаемому положительному эффекту явл ется способ иммобилизации микросом печени путем их ковалентного связы вания на полиэтилене с привитым со полимером с помощью пойеречно-сшивающего реагента, в качестве приви того сополимера используют полиакр ловую кислоту в количестве 6-10%, а в качестве поперечно-сшивающего реагента карбодиимид 2. Недостатками способа является низкая активность монооксигеназы у целевого продукта (25% от исходной) . а также необходимость исполь зования дорогостоящего карбодиимид Цель изобретения - повьтаение монооксигеназной активности целево продукта и удешевление способа пол . чения иммобилизованных микросом. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу иммобили зации микросом печени путем их ков лентйого связывания на полиэтилене с привитым сополимером с помощью поперечно-сшивающего реагента, в качестве привитого сополимера испо зуют полиаллиловый спирт в количест-ве 4-9%, а в качестве поперечно-сшивающего реагента 15-35%-ный п-бензохинон,причем массовое соотношение белок микросом и носителя составляет (0,3:10)-(1:10), Сущность способа заключается в использовании полиаллилового спирта в количестве 4-9% в качестве привитого сополимера и 15-55%-ный п-бензохинона в качестве поперечно-сшивающего реагента. Преимущества при этом возникают как за счет изменения структуры полимера, так и вследствие увеличения расстояния от микросом до матрицы при замене карбодиимида на бензохинон. Важным параметром при этом является соотношение белок микросом: носитель, которое должно быть в диапазоне от (0,3:10)-(1:10). Монооксигеназная активность в указанном интервале соотношений максимальна (таблица 1), при соотношении 1,25:10 значение активности также несущественно изменяется, однако при этом резко падает процент связывания белка микросом. При весовом соотношении 0,2:10 монооксигеназная активность составляет 70%. В таблице приведены также возможные интервалы параметров, касающихся концентрации п-бензохинона и полиаллилового спирта. Оптимальное значение количества привитого полиаллилового спирта составляет 4-9%. При использовании носителя с 2% полиаллилового спирта монооксигеназная активность составляет от максимальной, верхний предел (9%) полиаллилового спирта обусловлен возможностями метода радиационной прививки. Использование низких концентраций п-бензохинона приводит к снижение активности препарата, а его увелит1емие свьппе 35% нецелесообразно. Способ позволяет полностью сохранить монооксигеназную активность целевого продукта и удешевить процесс за счет использования доступного поперечно-сшивающего реагента. П р и м е р 1. Активация полиэтилена с 5,6% привитого полиаллилового спирта осуществляется следующим образом. К 9,0 г полиэтилена с 5,6% привитого полиаллилового спирта Б 560 мл 0,1 М KH PO /NaOH буфера, рН 8,0 (комнатная температзфа, перемешивание на магнитной мешалке) добавляют 139 мл 0,25 М раствора п-бензохинона в 96%-ном этаноле. Суспензию перемешивают 1 ч при комнатной температуре, затем переносят на воронку Бюхнера и промывают 20%-Hbw этанолом, дистиллированной водой, 1 М NaCt и сн ва дистиллированной водой. Используют нативные микросомы со следующими характеристиками: выход микросомального белка 24,5 м белка/г печени, активность по анилину 4,7 нмоль субстрата/нмоль цитохрома Р-450 в мин при 37°С. 1 г полученного полиэтилена с привитым полиаллиловым спиртом, активированные п-бензохиноном, суспендируют в охлажденном буфере рН 8,0 (0,1 М KHjPO /NaOH) со 100 мМ КСВ, 1.мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитола, приготовленном на 20%-но (по объему) глицерине. При пере- . мешивании на магнитной мешалкр к суспензии носителя добавляют суспе зию фракции микросом, содержащую 30 мг белка. Полученную суспензию инкубируют при перемешивании на магнитной мешалке 24 ч при 4-5°С, ,затем промьшают на воронке Бюхнера буфером Б, рН 7,4 (0,1 М KH, с 0,5 М КСе, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитио треитола, приготовленном на 20%-но глицерине, а затем аналогичньм буфером без KCt. Иммобилизованную фракцию микрос суспендируют в буфере А, рН 7,4. Монооксигеназная активность по анилину 6,66 нмоль субстрата/нмоль цитохрома Р-450 в мин при (сохранение активности в % от исхо ной 142,6%) в присутствии гидроперекиси кумола 0,49 нмоль субстрата/нмоль цитохрома Р-450 в мин при 37 С (сохранение активности от исходной - 207,1%) в присутствии НАДФН генерирующей системы и Oj и 0,77 нмоль субстрата/нмоль цитохрома Р-450 в мин при 37°С (сохранение активности от исходной 257,2%) в присутствии НАДФН и О,. Иммобилизованньге по данному способу микросомы стабильны при хранении в течение 6 мес при 4-5 С, за это время падение монооксигеназной активности составляет 20%. Температурный оптимум микросом печени, иммобилизованных на полиэтилене с привитым полиаллиловым спиртом , а рН - оптимум - 7,6. Пример 2. Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1. Отличие заключается лишь в том, что к 1 г полиэтилена с привитым полиаллиловым спиртом, активированным п-бензохиноном, добавляют при перемешивании суспензию фракции микросом, содержащую 100 мг белка. Монооксигеназная активность по анилину 6,90 нмоль субстрата/нмоль цитохрома Р-450 в мин при 37°С (сохранение активности в % от исходной 147,6) в присутствии гидроперекиси кумола, 0,51 нмоль субстрата/нмоль цитохрома Р-450 в мин при (сохранение активности в % от исходной - 214.6) в присутствии НАДФН - генерирующей системы и Oj . и 0,80 нмоль субстрата/нмоль цитохрома Р-450 в мин при (сохранение активности в % от исходной 266,5) в присутствии НАДФН и Oj. Применение предлагаемохО способа позволяет отказаться от использования дорогого и сложно синтезируемого карбодиимида-р-1-циклогексип-З-(2-морфомйноэтил)карбодиимид-мето-р-толуолсульфоната и заменить его более доступньм и дешевым п-бензохиноном, что значительно упрощает и удешевляет способ иммобилизахщи. Использование предлагаемого способа иммобилизации позволяет повысить моноксигеназную активность до 142-148% вместо 25% в прототипе (в присутствии гидроперекиси кумола) 207-215% (в присутствии НАДФН генерирующей системы и Oj) и 257-267% (в присутствии НАДФН и Oj), Способ прост в осуществлекни не требует особых условий при модификации носителя.

Количество привитого полиаллкпового спирта, Bec.Z

7,5

1А,9

35,2

Т -14.9

35.2 20.8 20,8 20.8 20.8 41.7 to,4

отношеМонооксигенаэнаяактивность иммобимикросом:лизованных микросом,нмоль субстрата/нмоль laiToxpoма Р-450 в мин при 1°С

3.9 6.3 6.5 4.1 6,7 6.6 4.8 6,7 6,9 6,8 6.7 5,3

СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ путем их ковалентного связывания на полиэтилене с привитык сополимером с помощью поперечносшивающего реагента, отличающийся тем, что, с целью повышения монооксигеназной активности целевого продукта и удешевления способа, в качестве привитого сополимера используют полиаллиловый спирт в количестве 4-9%, а в качестве поперечно-сшиваящего реагента 15-35%-ный п-бензохинон, причем массовое соотношение белка микросом и носителя составляет