Средство для реконструкции мембран IN VIтRо Советский патент 1992 года по МПК A61K31/685 A61K37/22 

Изобретение относится к биохимии и касается реактива - средства для реконструкции мембран in vitro.

Цель изобретения - повышение специфической активности.

П р и м е р 1. В круглодонную колбу объемом 500 мл помещают 2 г фосфатидилхолина хлопчатника, добавляют 20 мл диэ- тилового эфира, закрывают колбу пробкой и перемешивают содержимое до полного растворения фосфадилхолина (ФХхл). Диэтило- вый эфир упаривают досуха на роторном испарителе при , приливают к содержащемуся на станках колбы ФХхл 100 мл 0,2%-ного раствора тринатриевую соль гли- цирризиновой кислоты (ЫазГК) в 130 мм трио-буфера (рН-7,4), содержащего 200 мг ЫазГК. Интенсивно перемешивают содержимое до полного отделения ФХхл от стенок колбы и его солюбилизации. Образовавшуюся мутную жидкость переносят порциями по 4,0 мл в стеклянные стаканы, помещают их в емкость со льдом и воздействуют ультразвуком с частотой 44

кГц на ультразвуковом дезинтеграторе до получения прозрачной опалесцирующей жидкости. Общее время воздействия ультразвука составляет 15 мин. Полученную жидкость центрифугируют при 30 000 об/мин в течении 15 мин, Центрифугат использовали для репарации поврежденных мембран клеток печени. Получившая суспензия содержит 20 мг ФХхл и 2 мг ЫазГК в 1 мл, рН суспензии 7,4; размерчастиц 36-40 нм, осмолярность 210 мосмоль, оптическая плотность при нм составила 0,057. адсорбции суспензии при Я 660 нм - 91 %, прозрачность максимальная,

П р и м е р 2. По примеру 1 в круглодонную колбу вносят 2 гр, ФХхл и растворяют его в 20 мл органического растворителя. После полного растворения ФХхл диэтиловый эфир упаривают на роторном испарителе при . Затем к ФХхл, выкристаллизовавшемуся на стенках колбы, приливают 100 мл 130 мМ трис-HCI буф.раствора, содержащего 300 мг №зГК. Интенсивно перемешивают до его полной солюбилизации,

сл

с

2

XJ

о XJ

ю

Образовавшуюся мутную жидкость в стака ны для ультразвукового озвучивания и на холоду воздействуют ультразвуком с частотой 44 КГц в течении 15 мин Полученную прозрачную жидкость центрифугируют при 30000об/мин втечение 15мин. Полученная суспензия содержала 22 кг Фххл и 3 кг мг МазГК в 1 мл и имела следующие физико-химические свойства, рН-7,38, размер частиц 35-40 нм, осмолярность 210 мосмоль, опти- ческая плотность при Я-660 не 0,06; адсорбция суспензии при Я 660 нм составила 89,0%, прозрачность максимальная.

П р и м е р 3. По примеру 1, 2, 5 г ФХхл растворяли Q20 мл органического растворителя, высушивали его на роторном испарителе и солюбилизировали в 100 мл 130 мм TDvic-HCI буф. раствора, содержащего 400 мг ЫазГК. При выборе оптимальных кон- центраций составных частей суспензии испытаны следующие концентрации тринатриевой соли глицирризиновой (ЫззГК):0,05; 0,1; 0,15; 0,2: 0,25 мас.ч. на 1,0 мае,ч. фосфатидилхолина.

Об эффективности действия препарата судили по замедлению инактивации цитох- рома Р-450 в поврежденных микросомах после инкубации их с суспензией (повреждение микросом вызывали введением кры- сам гепатотоксинов ССЦ и гелиотрина). Количественно замедление инактивации цитохрома Р-450 определяли по времени полуинактивзции его t v:

Результаты исследований представлены в табл. 1.

Из таблицы видно, что концентрация МазГК 0,05 мас.ч. недостаточна для максимального проявления репарирующей спо- собности препарата, при концентрации №зГК от 0,1 до 0,2 мас.ч. наблюдали максимальный репарирующий эффект препарата, а при концентрации 0,2 и выше эффективность препарата оставалась без изменений, что явилось обоснованием для выбора концентрации ЫазГК: 0.1-0,2 мае.ч. на 1,0 мае ч. фосфатидилхолина хлопчатника

Конкретные примеры применения средства.

Об эффективности реконструкции мембран микросом печени в экспериментах in vitro судят по скорости инактивации циотох- рома Р-450 скрининг тесту, специфичному для повреждения эндоплазматического ре- тикулума печени.

Острые токсические повреждения печени вызывали введением гепатотропных

агентов: четыреххлористый углерод и гелиотрина

Фосфолипидными препаратами взятыми для сравнительного изучения их эффективности явились; 1) фосфотидилхолин хлопчатника с тринатриевой солью глицирризиновой кислоты (по предлагаемой суспензии для реконструкции мембран) ФХхл+ЫазГК; 2) фосфадилхолин хлопчатника с солодковым пенообразователем ФХхл+ГК; препарат Эссенциале-фирмы На- ттерман, ФРГ.

С целью репарации мембран микросхем, а также сравнения эффективности фосфолипидных препаратов фракцию мембран микросом выделяли из печени крыс с острым токсическими гепатитами, затем инкубировали их с препаратами фосфолипи- дов и регистрировали скорость инактивации цитохрома Р-450.

Инактизацию цитохрома Р-450 использовали как тест для определения состояния мембран Инактивацию регистрировали в течение 20 мин при 37°С.

Из таблицы видно, что время полуинак- тивэции фермента при острых токсических воздействиях на печень резко снижается (5- 8 мин). О хорошем репарирующей действии препаратов ФХхл+№зГК и ФХхл+СП можно судить по возрастанию времени полуактивации цитохрома Р-450, тогда как препарат эссенциале не оказывал репарирующего действия на поврежденные микросомы печени.

Репарация мембран эндоплазматического ретикулума печени крыс, поврежденных фосфолипазой А2.

В опытах in vitro использовали фосфо- липазу ) из пчелиного яда (ех Вге venum) фирмы Caltiochem (США) удельная активность которой равнялась 1000 ед. в мг, фосфолипаза А2 - фермент, гидрализующий фосфолипиды (в основном фосфатидилхо- лин в /8 -положении). Микросомы в этой серии выделяли из печени здоровых крыс. Микросомы инкубировали с . В табл. 3 определено время полуинактивации (t 1/2 цитохрома Р-450 в микросомах, поврежденных фосфолипазой А2.

Предлагаемое средство позволяет повысить уровень времени полуинактивации цитохрома Р-4500, что свидетельствует о репарационной активности предлагаемого средства.

Изучение восстановления функциональной активности поврежденных мембран.

О состоянии функциональной активности поврежденных мембран судили по скорости окисления субстратов цитохрома Р-450 анилина и аминопирина. Для изучения включения предлагаемого средства на скорость гидроксилирования анилина и ди- метилирования аминопирина использовали микросомы, поврежденные ф Аа.

Из табл. 3 видно, что в поврежденных микросомах скорость окисления обоих субстратов снижена. Инкубация поврежденных ФА2 микросом с указанным средством приведена к увеличению скорости окисления субстратов, что свидетельствует о восстановлении функциональной активности поврежденных мембран эндоплазматического ретикулума.

Скорость окисления анилина и аминопирина в микросомах печени крыс, поврежденных фосфолипазой Аа и инкубированных с суспензией ФХхл f ГК (нмоль) образовавшегося продукта в мин, белка приведена в табл.4.

Формула изобретения Средство для реконструкции мембран tn vitro, содержащее фосфатидилхолин хлопчатника и детергент, отличающее- с я тем, что, с целью повышения репарационной активности, в качестве детергента используют тринатриевую соль глицирризи- новой кислоты при соотношении фосфатидилхолин: детергент 1-0,1-0,2.

Изобретение относится к биохимии и касается средств для реконструкции мембран In vitro. Цель изобретения - повышение специфической активности. Предлагаемое средство состоит из фосфатидилхолина хлопчатника и тринатриевой соли глицирри- зиновой кислоты при соотношении 1,0:0,1- 0,2. Полученное средство применяется как реактив для реконструкции мембран при биохимических исследованиях. 4 табл.

Таблица 1

Время полуинактивации цитохрома Р-450 в поврежденных микросхемах печени крыс и проинкубированных с суспензией

Примечанием /2 цитохрома Р-450 в поврежденных микросхемах без инкубации с суспензией при СС Ц гепатите 5 мин., при гелиотриновом 8 мин.

Реконструкция поврежденных мембран эндоплазматичег.кого ретикулума фосфолипидными препаратами

Таблица 2

Примечание: Инкубацию микросом, обработанных ФА2, с

суспензией проводили на 3 мл фосфолипидной суспензии на 1 нмоль цитохрома Р-450 в течение 1 чпри4°С.

Таблица 3

Таблица 4