Способ определения активности концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы Советский патент 1983 года по МПК C12Q1/48 

сл

vl

оо

сл

ю Из.обретение относится к медицин в частности к клинической энзимоло гии, и может быть использовано в экспериментальных и клинических условиях соответствующих исследова тельских или лечебных учреждений д диагностики и контроля лечения лей козов, лимфом-и других лимфопролиферативных заболеваний. Известен способ определения кон цевой дезоксинуклеотидилтрансфераз .(КДТ), основанный на предварительной очистке КДТ.от примесей других полимераз. После выделения фермент в чистсм виде из биологического источника неочищенного фермента определяют ферментативную активнос .КДТ инкубацией в растворе, содержа щем матрицу-затравку и ралиоактивно меченный нукл озидтрифоофат, rto лимеризованный радиоактивный продукт синтеза,, связанный с затравко осаждают на фильтре, который промывают кислотой для удаления кисло торастворимого радиоактивно меченн го нуклеозидтрифосфата и количест во образующегося радиоактивного по лимерного продукта ферментативного синтеза определяют ргцщометриройа . нием фильтра С1 3. Недостат ками этого способа ae-f ляется то, что очистка фермента, вклю(чакн«ая вьщеяейие лимфоцитов из крови. Их лизис, а;емтрифугирование лизата, иэбиратвльну о сорбци содержащегчзся S фермента на фосфоцеллюлозу f последующее отделение фосфоцеплюлоэы от лизата« от1«:1вание фосфоцеллюлозы, десорбцию фермента с отьелтой фосфоцеллюлозы, трудоемка, ведет к разбавлению фе ялента элюируюцим раствором, что нежелательно, поскольку объемы биологических образ цов, получае «лх ох , например, крови. Ограничены. Наиболее 6л83КИМ к предлагаемсн4у является способ определения КДТ, включающий использование в качестве йсточн;1ка фермента иеочшценного биологического образца Этот способ заключается в инкубирования с матрицей-затравкой и меченым нук леозйдтрифосфат неиосредствеино супернатанта лйзйрованншс лимфо цитов, содержащего наряда с КДТ дФугие ма ричные ДНК-полимераЭЫ, ДНКазы, прЪтеазы, ДНК в комплексе с белками. В качестве матрицызатравки используют олигодезоксиадениловую кисяоту олигод Ag) а в ка 1естве меченого нуклеозидтрифосфата - дезоксигуанозинтрифосфат ,дгшее обрабатывают, как описано выше Указанный способ максимально прост, предусма±ривает возможность определения активности КТД не только в супернатантах лизатов лимфоцитов, но и в межклеточнь1Х жидких средах, где она может выполнять физиологически и патологически значимый синтез С2 . Однако известный способ не рассчитан на одновременное получение информации об активности КТД, проявляемой ею как на произвольно добавляемых в среду инкубации экзогенных затравках, так ц на затравках эндогенного происхождения предшествуивдих в неочищенном биологическс источнике фермента. Коммерческие олигод А &-че, используемые в аюсобе, малодоступны, лабораторшай синтез их трудоемок. Применение затравок олигод Ag.tjg в случае образования на них продуктов синтеза приводит -на этапе промывания кислотой преципитата на фильтре к утрате части затравок С радиоактивным продуктом в составе кислоторастворимой фракцииj что приводит к снижению чувствительности способа. Цель изобретения - повышение чувствительности способа, а также возможность осуществления способа в нативном материале. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности концевой дезоксинуклеотиди;птра нсферазы включаквдему инкубацию исследуемого материала с матриклей-затравкой и радиоактивно меченым нуклеозидтрифосфатом, вьщеление полимеризованного радиоактивного продукта на фильтре и радис 4етрироВани целевого продукта, в качестве затраВКИ. и.спальзуют денатурированную ДНК, при зтом ее вводят в инкубационную смесь в фиксированном состоянии на ДЕАЕфильтре,. дополнительно вводят контрольный ДЕАЕ-фильтр, далее ДЕАЕфильтры переносят в раствор немечён ного нуклеозидтрифосфата, проводят радиометри 1еский анализ обоих фильтров и активность фе ялентов определяют по сумме Д1зух значений. В случае использования в матрицы-затравки деяатурированной ДНК ДЕАЕ-бумагу перед псжещением в раствор с избытком немеченного нуклеозидфрифосфата дополнительно выдержи вают в pactBope ДВКазы Способ схгуществляют следующим образом. фильтры приготовляют в виде полудисков диа 1етром 22 мм из ДБДБ-бумаги (Serva, ФРГ,емкость, 0,4 мзкв/г, вьтеряшваю : их 20 мин в растворе денатурированной ДНК (молекулярная масс& не менее 1x10 дальтон V концентрации 1,5 мг/мл до насыщения-, промывают дистиллированной водой для удаления несвязавшихся с фильтром молекул. Активацию денатурированной ДНК производят выдерживанием 15 мин в растворе ДНКазы 1 концентрации 4 мг/мл с последующим промыванием водой и дополнительным насыщением остаточных свободных, мест связывания выдерживанием 20 мин в 0,04 М растворе немеченых дезоксигуанозинтрифосфата -или аденозинтрифосфата.. Приготовленные таким образом фильтры из ДЕАЕ-бумаги сохраняются в сухсяй состоянии неограниченное время перед использованием. Для уче та синтеза на эндозатравках фильтры не требуют предварительной обработки, их нарезают из ДБАЕ-бумаги. Пример 1., В качестве биоло гического источника фе1 1ента применяют межклеточную среду тимоцитов крае, для чего суспензию клеток Ц0 клеток/МП )/после выделения их ид тимуса крыс общепринятым методом Юсвобождают от клеток центрифугарованием ((800 д затем 100.000 д./ 100 мкя супернатанта соединяют с 100 мкл На-какодилатного буфера (250 мМ Яа-какодйлата, 1 МГ: бычьего сывсчроточного альбумина, 300. мМ NaCl, содержащего 2 i Н j дГТФ G удельной активностью 9,25 ГБК/ммол и 1,2 мМ MnCl2. Сразу после соединения двух объемов в общий объем помещают фильтры йэ ДЕ -бумаги. При необходимости объем супернатаита может быть уменьшен в 10 ра ирй соответствующем уменьшении o6if&ta буфера и площади фильтров. очередность внесения блокированного экзозатравкой или свобсв ного фнлбтра в инкубационный раствор произвольная 8 зависимости от цепей эксперимента, однако при установлеНИИ соотношения двух видов синтезе; на экдо- и экзозатравках два фильтр бводят в инкубauHOHHbtft раствор одновременно с биологическим источник ксмч неочищенного фермента и раствор инкубируют лри 27°е одинаковое время 120 мин).. За начало отсчета вреМёни синтеза на эндозатравках прини мают момент сое&инения источника 4 рмента с. меченньоли предшественниками, а синтеза на зкзозатравках момент погружения фильтра - носителя затравки: в инкубационный объем/ После изъятия фильтров из инкубационного раствора их ополаскивгиот от остатков - инкубационного раствс ра 1 л дистиллированной воды и высушивают, затем выдерживают в 1,5 мл раствора немеченного трифосфата ,04 М АТФ или ДГТФ ) 3 ч при 50с для удаления с бумаги остатков радиоактивного нуклеозидтрифосфата путем его замещения немеченным трифосфатом. Затем фильтры промывают 1 л дистиллированной воды, сушат и радиометрируют.. Результаты выражают в единицах ферментативной активности КДТ, 1 ед-1 нмоль полимеризованного мономерного предшественника на 10 клеток за 1 ч. Соотношение двух видов синтеза в данном примере составляет ,:С, 0/47:0,53 при суммарной гжтивности фермента равной 1,21(. Пример 2. Все операции выполняют как в примере 1, только производят последовательное помещение в инкубационшлй объем вначале свободного фильтра(для учета активности на эндозатравках Л а спустя 20 мин его заменяют фильтром с ДНК-затравкой (для учета активности фермента на экзoзaтpaвKe i Соотношение .C yj ЗИАОсоставляет 0,27:0,73 при суммарной активности фермента равной 1, ед. Пример 3. Лимфоидные клетки выделяют из крови людей известным методом в градиенте фикола, суспензию клеток объемом 0,3 МП с концентрацией 1-1,510 клеток/мл в какодилатном буфере-((125 мМ На какодилатс, 5 КЙ4 дитиотр-ейтола, 0,5 мг бычьего , сывороточного альбумина и 150 мМ Nad) после выделения подвергают ультразвуковой о&работке на установке УРСК-7Н при температуре тающего ЛБда при 27 кГц по 2 с 10 раз с интервалами 30 с и центрифугируют при 100.000 д Полученный таким образом супернатант биологический источник фермента объемом 100 Мкл соединяют со 100 мкл раствора рнЗ- дГТФ ( 2 мМ удельцая активность 0,25 ГБК/кмопь) на вьше описанном какодилатном буфере/ содержащ&л 1,2 мМ MnClj У больной, страдающей лимфопролиферативньм заболеванием, при одновременном режиме инкубации фильтров установлена активность КТД на экзоэатравке - 5,1 ед;, на эндозатравке 3,2 ед. .суко арный синтез - 8,3 ед. Активность КДТ, определенная по известнЬму способу - 1,24 ед. Замена , На в среде инкубсщии на К- приводит к увеличению компоненты активности на экзозатравке до 5,6 ед., что указывает на ограниченную пригодность иммобилизованной на анионноооменнике ДНК служить матрицей для матричных полимераз, так как этот ВИД синтеза не превышает 10%, но в TO же время (этравдывает применение нигибирующей матричные полимеразы концентрации На в предлагаемом способе. У 8 человек, не страдающих лимфопролиферативньми заболеваниями, получено среднее значение суммарной активности фермента при одновремен5 .1057852«

ной инкубации анионообменников, рав-рированной ДНК без ущерба для селекное 0,4+0,17 ед. Средняя активностьтивных в отношении КДТ сэойств спофермента, установленная по извест-соба за счет иммобилизации ДНК на

ному способу,- 0,082 ед.фильтре из ДВАЕ-бумаги и увеличеТаким образом, предлагаемый спо- 5за счет обработки ДНКазой и упрособ позволяет увеличить чувствитель-щает вшюлненяе процедур по пригоность по сравнению с известным при-товлению инкубгщионного раствора,

мерно в 5 раз, дает принципиальнотак как та часть процедур, которая

новую информацию о соотношении двухсвязана с приготовлением экзозатравидов активности фермента на зат- Ювок, может вьтолняться заранее и

равках различного происхождения-при приготовлении инкубационного

без увеличения количества опытов,раствора сводиться к минимуму - попозволяет заменить малодоступные гружению готовых фильтров из ДЕЛЕолиго- и ПОЛИ-Д(А ) дешевой денату-бумаги в раствор. ния в ней количества активных концов

CnOCOfi ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КОНЦЕЮЙ ДЕЭОКСИНУКЛЕОТИДИЛТРАНСФБРАЗЫ, вкштчакхций инкубацию исследуемого материала с матрицейзатравкой и радиоактивно меченом нуклеозидтрифосфатом, выделение попимеризованного ргшиоактивного продукта на фильтре и ргцшометрирование целевого процукта, о т л ичаю14ийся тем, что, с целью повьаиения чувствительности способа, а также возможности осуществления способа в нативном материале в качестве затравки используют денатурированную ДНК, при этом ее вводят в инкубационную смесь в фиксированном СОСТОЯНИЙ на ДЕАЕ-фнльтре, дополнительно вводят контрольный ДЕДЕфильтр, далее ДЕЛЕ-фильтры переносят Щ в раствор иш4еченного нуклеозидтрифосфата, проводят радиометрический анализ обоих фильтров и активность фермента (этределяют по cyi«ie двух значений.