СПОСОБ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК, СПОСОБ КЛОНИРОВАНИЯ ВТОРОЙ кДНК И СПОСОБ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ДНК Российский патент 2007 года по МПК C12N15/52 C12N9/12 C12Q1/68 

Настоящее изобретение относится к термостабильному ферменту, который является ДНК-полимеразой, получаемой из Anaerocellum thermophilum.

Термостабильные полимеразы (ЕС 2.7.7.7.ДНК-нуклеотидилтрансфераза, ДНК-управляемая) были выделены из многочисленных термофильных организмов (например, Kaledin et al., 1980, Biokimiya Vol.45, р.644-651; Kaledin et al., 1981, Biokimiya Vol.46, p.1247-1254; Kaledin et al., 1982, Biokimiya Vol.47, p.1515-1521; Ruttimann, et al., 1985, Eur. J. Biochem. Vol.149, p.41-46; Neuner et al., 1990. Arch. Microbiol. Vol.153, p.205-207).

Для некоторых организмов ген полимеразы был клонирован и экспрессирован ((Lawyer et al., 1989, J. Biol. Chem. Vol.264, p.6427-6437; Engelke et al., 1990, Anal. Biochem. Vol.191, p.396-400; Lundberg et al., 1991, Gene, Vol.108, p.1-6; Kaledin et al., 1980, Biokimiya Vol.44, p.644-651; Kaledin et al., 1981, Biokimiya Vol.46, p.1247-1254; Kaledin et al., 1982, Biokimiya Vol.47, p.1515-1521; Ruttimann et al., 1985, Eur. J. Biochem. Vol.149, p.41-46; Neuner et al., 1990, Arch. Microbiol. Vol.153, p.205-207; Perler et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.89, p.5577).

Термофильные ДНК-полимеразы становятся все более важными инструментами для использования в области молекулярной биологии и наблюдается возрастающий интерес к обнаружению новых полимераз, которые обладали бы более подходящими свойствами и активностями для диагностического определения РНК и ДНК, клонирования генов и секвенирования ДНК. В настоящее время термофильные ДНК полимеразы, которые в большинстве случаев используют для этих целей, являются полимеразами видов рода Thermus подобно Tag-полимеразе из Т. aquaticus (Brock et al., 1969, J. Bacteriol. Vol.98, p.289-297).

Обратная транскрипция обычно осуществляется вирусными обратными транскриптазами, подобными ферментам, выделенным из вируса миелобластоза птиц или вируса лейкемии мышей Moloney, которые активны в присутствии ионов магния, но отличаются тем недостатком, что обладают активностью РНКазы Н, которая разрушает матричную РНК в процессе обратной транскрипции, и имеют температурный оптимум при 42 или 37°С соответственно.

Описываются альтернативные способы, в которых используют обратно-транскриптазную активность ДНК-полимераз термофильных организмов, которые активны при более высоких температурах. Обратная транскрипция при более высоких температурах обладает тем преимуществом, что избегает образования вторичных структур РНК-матрицы, которые могут привести к появлению продуктов преждевременного окончания транскрипции. Термостабильные ДНК-полимеразы с обратной транскриптазной активностью обычно выделяют из видов рода Thermus. Однако ДНК-полимеразы демонстрируют обратно-транскриптазную активность только в присутствии ионов марганца. Эти условия реакции являются субоптимальными, так как присутствие ионов марганца снижает точность транскрибирования матричной РНК ДНК-полимеразой.

Поэтому желательно создать обратную транскриптазу, которая функционировала бы при более высоких температурах, чтобы избежать образования вторичных структур матрицы, и была бы активной в присутствии ионов магния, чтобы получать кДНК с РНК- матриц с более высокой точностью.

Настоящее изобретение направлено на удовлетворение данных потребностей и обеспечивает очищенную ДНК-полимеразу (ЕС 2.7.7.7.), активную при более высоких температурах, которая обладает обратно- транскриптазной активностью в присутствии ионов магния. Изобретение включает ДНК полимеразу, выделенную из Anaerocellum thexmophilum DSM 8995, депонированную в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig. С другой точки зрения, изобретение включает ДНК-полимеразу, которая катализирует матричную прямую полимеризацию ДНК и обладает 5'-3' полимеразной активностью, 5'-3' экзонуклеазной активностью и не обладает 3'-5' экзонуклеазной активностью.

Полимераза по настоящему изобретению сохраняет, по крайней мере, 90% своей активности после инкубирования в течение 30 минут при температуре 80°С в отсутствие стабилизирующих детергентов.

Другой аспект изобретения включает ДНК-полимеразу, обладающую молекулярной массой около 96-100 кДа по данным PAGE анализа активности in situ.

С другой точки зрения, изобретение включает ДНК-полимеразу, которая обладает обратно-транскриптазной активностью в присутствии ионов магния и практически в отсутствие ионов марганца. Полимераза по настоящему изобретению демонстрирует Mg²⁺-зависимую обратно-транскриптазную активность, составляющую более чем 30% по сравнению с ДНК-полимеразной активностью, которую принимают за 100%. Следующий аспект настоящего изобретения включает термостабильную ДНК-полимеразу, причем указанная полимераза демонстрирует обратно-транскриптазную активность, которая зависит от Mn²⁺. Mn²⁺-зависимая обратно-транскриптазная активность составляет более 60% по сравнению с ДНК-полимеразной активностью.

С другой точки зрения, настоящее изобретение включает термостабильную обратную транскриптазу. Термостабильная обратная транскриптаза сохраняет более 80% своей активности после инкубирования в течение 60 минут при 80°С.

Кроме того, была выделена ДНК, кодирующая термостабильную ДНК-полимеразу массой 96000-100000 Дальтон, получаемую из Anaerocellum thermophilum, что позволяет получать термостабильный фермент по настоящему изобретению путем экспрессии в E.coli. Полная последовательность, кодирующая ДНК-полимеразу Anaerocellum thermophilum, приведена ниже как последовательность ИД №7. Рекомбинантная ДНК-полимераза Anaerocellum thermophilum также обладает 5'-3'-полимеразной активностью, не обладает существенной 3'-5'-экзонуклеазной активностью, 5'-3'-экзонуклеазной активностью и обратно-транскриптазной активностью, которая зависит от Mg²⁺.

Anaerocellum thermophilum был выделен из горячего источника в Долине гейзеров на Камчатке (V.Svetlichny et al. Mikrobilogiya, Vol.59, №5, р.871-879, 1990). Anaerocellum thermophilum был депонирован в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig в соответствии с Будапештским соглашением и получил регистрационный номер DSM 8995. Термостабильная полимераза, выделенная из Anaerocellum thermophllum, имеет молекулярную массу 96-100 кДа и сохраняет более 90% активности после нагревания до 80°С в течение 30 минут в отсутствие стабилизирующих детергентов. Термостабильный фермент обладает 5'-3'-полимеразной активностью и обратно-транскриптазной активностью, которая является как Mn⁺⁺-, так и Mg⁺⁺-зависимой. Термостабильный фермент может быть нативным или рекомбинантным и может быть использован для синтеза первой и второй цепочки кДНК, при клонировании кДНК, секвенировании ДНК, мечении ДНК и амплификации ДНК.

В настоящем изобретении обеспечены усовершенствованные способы репликации и амплификации последовательностей дезоксирибонуклеиновой (ДНК) и рибонуклеиновой (РНК) кислот. Данные усовершенствования достигнуты в результате обнаружения и применения ранее неизвестных свойств термоактивных ДНК-полимераз. В предпочтительном осуществлении изобретение обеспечивает способ получения комплементарной копии ДНК с РНК-матрицы с помощью термореактивной ДНК-полимеразы. С другой точки зрения, настоящее изобретение обеспечивает способы амплификации сегмента ДНК с ДНК- или РНК-матрицы с использованием термостабильной ДНК-полимеразы (RT-ПЦР или ПЦР).

Термин "обратная транскриптаза" описывает целый класс полимераз, характеризуемых как РНК-зависимые ДНК-полимеразы. Все известные обратные транскриптазы требуют праймера для синтеза ДНК-транскрипта с РНК-матрицы. Исторически, обратную транскриптазу использовали, главным образом, для транскрибирования мРНК в кДНК, которую затем клонировали в вектор для дальнейших манипуляций.

Для выделения нативного белка Anaerocellum thermophilum может быть культивирован с применением любой подходящей методики, как, например, методики, описанной Svetlichny et al., 1991, System. Appl. Microbiol. Vol.14, p.205-208. После того как клетки выросли, один из предпочтительных способов выделения и очистки фермента осуществляют, используя многостадийный процесс следующим образом.

Клетки оттаивают, суспендируют в буфере А (40 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,4 М NaCl, 10 мМ Pefabloc^TM SC (4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонилфторид гидрохлорид) и лизируют, дважды пропуская через гомогенизатор Gaulin. Сырой экстракт осветляют центрифугированием, надосадочную жидкость диализуют против буфера В (40 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина) и наносят на колонку, заполненную гепарин-сефарозой (Pharmacia). В каждом случае колонки уравновешивают исходным растворителем и после нанесения образца колонки промывают трехкратным их объемом данного растворителя. Элюирование из первой колонки проводят с линейным градиентом от 0 до 0,5 М NaCl в буфере В. Фракции, демонстрирующие полимеразную активность, собирают и добавляют сульфат аммония в конечной концентрации 20%. Данный раствор наносят на гидрофобную колонку, содержащую Butyl-TSK-Toyopearl (TosoHaas). Данную колонку элюируют по снижающемуся градиенту сульфата аммония 20-0%. Фракцию, содержащую активность, диализуют и снова переносят в колонку с ДЭАЭ-сефарозой (Pharmacia) и элюируют по линейному градиенту 0-0,5 М NaCl в буфере В. Четвертая колонка содержит Tris-Acryl-Blue (Biosepra) и ее элюируют, как и в предыдущем случае. И, наконец, активные фракции диализуют против буфера С (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 7,0 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 мМ NaCl 50% глицерина).

ДНК- полимеразную активность измеряли, либо вводя ³²P-дГТФ, либо вводя меченный дигоксигенином дУТФ в синтезированную ДНК. Определение и количественный анализ включенного дигоксигенина проводили, по существу, как описано в Holtke. H.-J.; Sagner, G.Kessler, С.Schniitz. G., 1992, Biotechniques Vol.12, p.104-113.

Обратно-транскриптазную активность измеряли, используя поли-А-матрицу, праймированную олиго дТ, либо вводя ³²Р дТТФ, либо вводя меченный дигоксигенином дУТФ в комплементарную цепь. Определение включенного дигоксигенина проводили по аналогии с процедурой, применяемой для определения ДНК-полимеразной активности.

In situ PAGE анализ полимеразной активности и обратно-транскриптазной активности проводили, по существу, в соответствии с методикой, описанной Spanos А. и Hübscher U., 1983, Methods in Enzymology Vol.91, p.263-277. Некоторые небольшие, но существенные модификации исходной методики состоят в том, что ренатурацию ДДС денатурированных полипептидов проводят в присутствии ионов магния (3 мМ) и дАТФ (0,5-1 мкМ) для восстановления пространственной структуры (складчатости).

Термостабильный фермент по данному изобретению может быть также получен по методу рекомбинантных ДНК, так как ген, кодирующий данный фермент, был клонирован из геномной ДНК Anaerocellum thermphilum. С другой точки зрения, изобретение включает рекомбинантную плазмиду, содержащую вектор pASK75, содержащий ген ДНК-полимеразы Anaerocellum thermophilum и обозначаемый pAR10.

Выделение рекомбинантного клона, экспрессирующего ДНК-полимеразу из Anaerocellum thermophilum, включает следующие стадии: хромосомную ДНК из Anaerocellum thermphilum выделяют, обрабатывая клетки детергентом, например ДДС, и протеиназой, например протеиназой К. Раствор экстрагируют добавлением фенола и хлороформа и ДНК очищают, осаждая этанолом. ДНК растворяют в Трис/ЭДТА буфере и ген, кодирующий ДНК-полимеразу, специфично амплифицируют по методу ПЦР, используя два смешанных олигонуклеотида (праймеры 1 и 2). Данные олигонуклеотиды, описанные в последовательности ИД №1 и в последовательности ИД №2, были сконструированы на основе консервативных участков ДНК полимераз семейства А, что опубликовано Braithwaite D.К. и Ito J., 1993, Nucl. Acids Res. Vol.21, p.787-802. Специфично амплифицированный фрагмент лигируют в вектор, предпочтительно вектор pCR^TMII (Invitrogen), и последовательность определяют по методу циклического секвенирования. Полное выделение кодирующего участка и фланкирующих последовательностей гена ДНК полимеразы можно осуществить с помощью рестрикционной фрагментации ДНК Anaerocellum thermophilum другим ферментом рестрикции, как в первом цикле скрининга, и с помощью обратной ПЦР (Innis et al. (1990) PCR Protocols; Academic Press. Inc., p.219-227). Это можно осуществить с помощью синтезированных олигонуклеотидных праймеров, связывающихся с внешними последовательностями ДНК части гена, но противоположно ориентированных. Данные олигонуклеотиды, описываемые Последовательностями ИД №№3 и 4, были сконструированы на основе последовательностей, которые были определены в первой описанной выше ПЦР. В качестве матрицы используют ДНК Anaerocellum thermophilum, которую расщепляют рестрикционным расщеплением и замыкают в цикл путем взаимодействия с Т4 ДНК-лигазой. Для выделения кодирующего участка целого полимеразного гена проводят еще одну ПЦР, используя праймеры, показанные в Последовательностях ИД №№5 и 6, для амплификации полного гена ДНК-полимеразы непосредственно из геномной ДНК и встраивания концов, совместимых с линеаризованным экспрессирующим вектором. Последовательность ИД №1:

Ген оперативно связывают с соответствующими контрольными последовательностями для экспрессии либо в прокариотической, либо в эукариотической системе хозяин/вектор. Вектор, предпочтительно, кодирует все функции, необходимые для трансформации и сохранения в подходящем хозяине, и может кодировать избираемые маркеры или/или контрольные последовательности для экспрессии полимеразы. Активную рекомбинантную термостабильную полимеразу можно получить, трансформируя культуры хозяев либо непрерывно, либо после индуцирования экспрессии. Активную термостабильную полимеразу можно выделить либо из клеток хозяина, либо из культуральной среды, если белок секретируется через клеточную мембрану.

Также предпочтительно, чтобы экспрессия термостабильной полимеразы Anaerocellum thermophilum строго контролировалась бы в E.coli во время клонирования и экспрессии. Векторы, применимые в практике настоящего изобретения, должны обеспечивать различные степени контролируемой экспрессии Anaerocellum thermophilum полимеразы, обеспечивая некоторые или все из следующих контрольных особенностей: (1) промоторы или сайты инициации транскрипции либо непосредственно прилегающие к началу гена полимеразы, либо как гибридные белки, (2) операторы, которые можно использовать для "включения" или "выключения" экспрессии гена, (3) сайты связывания рибосом для улучшенной трансляции и (4) сайты окончания транскрипции или трансляции для повышения стабильности. Подходящие векторы, применяемые для клонирования и экспрессии полимеразы Anaerocellum thermophilum, включают, например, фаги и плазмиды. Примеры фагов включают лямбда gtl1 (Promega), лямбда Dash (Stratagene) лямбда ZapII (Stratagene). Примеры плазмид включают pBR322, pBTac2 (Boehringer Mannheim), pBluescript (Stratagene), рЕТ3А (Rosenberg, A.H. el al. (1987) Gene 56:125-135), pASK75 (Biometra) и pET11C (Studier, F. W. et al. (1990) Methods In Enzymology, 185:60-89). Было показано, что использование плазмид в соответствии с настоящим изобретением является выгодным, особенно это касается pASK75 (Biometra). Далее плазмиду pASK75, содержащую ген ДНК-полимеразы Anaerocellum thermophilum, обозначают pAR10.

Существуют стандартные методики трансформации, инфицирования фагом и культивирования клеток (Maniatis. et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press). Из многочисленных штаммов E.coli, которые можно использовать для трансформации плазмидами, предпочтительные штаммы включают JM110 (АТСС 47013). LE392 pUBS 520 (Maniatis et al. supra; Brinkmann et al. (1989) Gene 85:109-114), JM101 (ATCC №33876), XL1 (Stratagene) и RR1 (ATCC №31343), и BL21 (DE3) plysS (Studier, F. W. et al. (1990) Methods in Enzymology, supra. Как было показано, выгодным в соответствии с настоящим изобретением является использование штамма LE392 pUBS 520 E.coli. Штамм LE392 pUBS 520 Е.coli, трансформированный плазмидой pASK75, содержащей ген ДНК-полимеразы Anaerocellum thermophilum (обозначаемой pAR10), обозначают далее как E.coli AR220 (DSM №11177). Штамм XL1. Blue E.coli (Stratagene) относится к штаммам, которые можно использовать для фага лямбда, a Y1089 можно использовать для лямбда gtl1-лизогении. Трансформированные клетки, предпочтительно, выращивают при 37°С, а экспрессию клонированного гена индуцируют ангидротетрациклином.

Выделение рекомбинантной ДНК-полимеразы можно осуществить стандартными методами. Выделение и очистку ДНК-полимеразы из экстракта E.coli можно осуществить стандартными методами. Данные методы включают, например, методы, использующие растворимость, такие как осаждение солью и осаждение растворителем, методы, использующие разницу по молекулярной массе, такие как диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация и электрофорез в ДДС-полиакриламидном геле, методы, использующие различие в электрических зарядах, такие как ионообменная колоночная хроматография, методы, использующие специфичные взаимодействия, такие как аффинная хроматография, методы, использующие различия в гидрофобности, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой, и методы, использующие различия в изоэлектрических точках, такие как электрофорез с изоэлектрическим фокусированием.

Термостабильный фермент по данному изобретению можно использовать для любых целей, когда необходима или желательна такая ферментативная активность. В наиболее предпочтительным воплощении фермент катализирует реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, известную как ПЦР. Данный процесс амплификации последовательностей нуклеиновых кислот описан и заявлен в ЕР 0201189. Метод амплификации нуклеиновой кислоты посредством ПЦР включает амплификацию, по крайней мере, одной специфической последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в нуклеиновой кислоте или в смеси нуклеиновых кислот, и получение двухцепочечной ДНК. Любая последовательность нуклеиновой кислоты в очищенной или в неочищенной форме может быть использована в качестве исходной нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот) при условии, что она содержит (или предположительно содержит) желаемую специфическую последовательность нуклеиновой кислоты. Нуклеиновую кислоту, подлежащую амплификации, можно получить из любого источника, например из такой плазмиды, как pBR322, из клонированной ДНК или РНК, из природной ДНК или РНК из любого источника, включая бактерии, дрожжи, вирусы, органеллы и такие высшие организмы, как растения и животные, или из препаратов нуклеиновых кислот, полученных in vitro. ДНК или РНК можно выделить из крови, такого тканевого материала, как хорионические ворсинки или амниотические клетки, различными методами. Смотри, например, Maniatis Т. et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), pp.280-281. Таким образом, в этом способе можно использовать, например, ДНК или РНК, включая матричную РНК, причем ДНК или РНК могут быть как одноцепочечными, так и двухцепочечными. Кроме того, можно использовать гибрид ДНК-РНК, который содержит по одной цепочке каждой из них.

Амплификацию последовательностей-мишеней в ДНК или с РНК можно осуществить для доказательства присутствия конкретной последовательности в образце нуклеиновой кислоты, подлежащей анализу, или для клонирования специфического гена. Для этих процессов очень подходят ДНК-полимеразы из Anaerocellum thermophilum. Благодаря тому, что ДНК-полимераза из Anaerocellum thermophilum требует ионов Mg⁺⁺ в качестве кофактора, вместо Mn⁺⁺ подобно другим полимеразам из термофильных организмов с обратно-транскриптазной активностью, известных специалистам, РНК-матрицы могут быть скопированы с более высокой точностью. Эти свойства делают ДНК-полимеразу из Anaerocellum thermophilum весьма полезным инструментом для молекулярной биологии.

ДНК-полимераза из Anaerocellum thermophilum может также быть использована для упрощения и усовершенствования способов определения молекул-мишеней РНК в образце. В данных способах ДНК-полимераза из Anaerocellum thermophilum катализирует: (а) обратную транскрипцию, (b) синтез второй цепочки кДНК и, при желании, (с) амплификацию с помощью ПЦР. Использование ДНК-полимеразы из Anaerocellum thermophilum в описанных способах устраняет необходимые ранее требования проведения двух наборов условий инкубации, что было необходимо из-за использования различных ферментов на каждой стадии. Использование ДНК-полимеразы из Anaerocellum thermophilum обеспечивает обратную транскрипцию и амплификацию получаемой комплементарной ДНК, что повышает специфичность, и предусматривает меньше стадий, нежели при известном ранее клонировании РНК и диагностических методиках.

Краткое описание рисунков

На фиг.1 представлена фотография анализа ДНК-полимеразы, осуществленного in situ. ДНК-полимеразную активность ДНК-полимеразы из Anaerocellum thermophilum анализируют в сравнении с ДНК-полимеразой I, фрагментом Кленова E.coli и ДНК полимеразой из Thermus thermophilus. Фракцию ДНК-полимеразы из Anaerocellum thermophilum подвергали электрофорезу на ДДС-полиариламидном геле, содержащем активированную (DNAseI-обработанную) ДНК. После электрофореза ДДС удаляли, белки ренатурировали в течение ночи и инкубировали при 72°С в присутствии соли магния, дНТФ и меченных дигоксигенином дУТФ для обеспечения синтеза комплементарной цепи. Получали блот нуклеиновой кислоты на нейлоновой мембране и вновь синтезированную ДНК регистрировали с помощью хемилюминесцентной реакции.

В качестве контрольных белков на том же геле анализировали ДНК-полимеразу I, фрагмент Кленова E.coli и ДНК-полимеразу из Thermus thermophilus. Используя данные белки в качестве стандартов, кажущуюся молекулярную массу ДНК-полимеразы из Anaerocellum thermophilum можно определить как 96000-100000 Дальтон.

На фиг.2 представлены результаты, полученные в анализе, в котором определяли относительную обратно-транскриптазную активность в зависимости от изменения концентрации ионов магния и марганца.

На фиг.3 показана термостабильность ДНК-полимеразы из Anaerocellum thermophilum. Аликвоты ДНК-полимеразы инкубировали при 80°С и активность измеряли в моменты времени, указанные на фигуре.

На фиг.4 представлена последовательность ДНК (Последовательность ИД №7) гена полимеразы Anaerocellum thermophilum и производная пептидная последовательность (Последовательность ИД №8) полимеразы Anaerocellum thermophilum.

На фиг.5 представлено сравнение обратно-транскриптазной активности полимеразы Anaerocellum thermophilum с таковой Thermus filiformis и Thermus thermophilus.

ПРИМЕР 1

Выделение ДНК-полимеразы

Для выделения нативного белка Anaerocellum thermophilum можно выращивать, используя любую подходящую методику, как, например, методику, описанную Svetlichny et al., 1991, System. Appl. Microbiol. Vol.14, p.205-208. После культивирования клеток осуществляют один предпочтительный способ выделения и очистки фермента, используя следующий многостадийный процесс:

Клетки оттаивают, суспендируют в буфере А (40 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,4 М NaCl, 10 мМ Pefabloc^TM SC (4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторида гидрохлорид) и осуществляют лизис, используя двукратное пропускание через гомогенизатор Gaulin. Сырой экстракт осветляют центрифугированием, надосадочную жидкость диализуют против буфера В (40 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина) и наносят на колонку, заполненную гепарин-сефарозой (Pharmacia). В каждом случае колонки уравновешивают исходным растворителем и после нанесения образца колонки промывают данным растворителем в трехкратном объеме колонки. Элюирование из первой колонки ведут по линейному градиенту от 0 до 0,5 М NaCl в буфере В. Фракции, демонстрирующие полимеразную активность, собирают и добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 20%. Данный раствор наносят на гидрофобную колонку, содержащую Butyl-TSK-Toyopearl (TosoHaas). Данную колонку элюируют по снижающемуся градиенту концентрации сульфата аммония 20-0%. Фракцию, содержащую активность, диализуют и снова переносят в колонку с ДЭАЭ-Сефарозой (Phannacia) и элюируют по линейному градиенту 0-0,5 М NaCl в буфере В. Четвертая колонка содержит Tris-Acryl-Blue (Biosepra), ее элюируют, как и в предыдущем случае. И, наконец, активные фракции диализуют против буфера С (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 7,0 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 мМ NaCl, 50% глицерина).

ПРИМЕР 2

Определение эндонуклеазной, экзонуклеазной и рибонуклеазной активности

Отсутствие эндонуклеазной активности: 1 мкг плазмидной ДНК инкубируют в течение 4 часов с избытком очищенной ДНК-полимеразы в 50 мкл тестового буфера с нанесенным слоем парафинового масла при 72°С.

Отсутствие неспецифической экзонуклеазной активности: 1 мкг EcoRI/HindIII-фрагментов ДНК-лямбда инкубируют в 50 мкл тестового буфера в отсутствие или в присутствии дНТФ (1 мМ конечной концентрации каждый) с избытком очищенной ДНК-полимеразы в течение 4 часов при 72°С с нанесенным слоем парафина.

Отсутствие рибонуклеазной активности: 3 мкг РНК MS2 инкубируют с избытком ДНК-полимеразы в 20 мкл тестового буфера в течение 4 часов при 72°С. РНК затем анализируют с помощью электрофореза в MOPS-геле (Maniatis Т. et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York).

ПРИМЕР 3

Определение ДНК-полимеразной активности

ДНК-полимеразную активность определяют, либо включая ³²Р-дГТФ, либо включая меченный дигоксигенином дУТФ в синтезируемые ДНК.

Регистрацию и количественное определение включения ³²Р-дГТФ измеряли следующим образом. Реакционная смесь содержала 50 мМ Трис-HCl, рН 8,5; 12,5 мМ (NH₄)₂SO₄; 10 мМ KCl; 5 мМ MgCl; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 200 мкг/мл BSA, 200 мкМ дАТФ, дГТФ и дТТФ, 100 мкМ дЦТФ, 12 мкг активированной ДНКазой ДНК из тимуса теленка и 0,1 мкл ³²Р-дЦТФ (10 мКи/мл, 3000 Ки/ммоль). После инкубирования в течение 30 мин при 70°С образец помещали на лед, добавляли 250 мкл 10% трихлоруксусной кислоты и образцы перемешивали и инкубировали в течение еще 10 мин на льду.

150 мкл образцов фильтровали через нейлоновые мембраны, фильтры промывали четыре раза 5% трихлоруксусной кислотой. Фильтры сушили в течение 30 минут при 80°С, и радиоактивность, связанную на фильтрах, определяли с помощью счетчика бета-частиц Packard Matrix 96 Direct Beta Counter.

Регистрацию и количественное определение включенного дигоксигенина осуществляли, как описано Höltke, H.-J.; Sagner, G., Kessler, С. и Schmitz, G., 1992, Biotechniques Vol.12, p.104-113. Обычно этот анализ осуществляют в общем объеме 50 мкл реакционной смеси, состоящей из 1 или 2 мкл разбавленной (0,05-0,01 Ед) ДНК-полимеразы и 50 мМ Трис-HCl, рН 8,5; 12,5 мМ (NH₄)₂SO₄; 10 мМ KCl; 5 мМ MgCl₂; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 33 мкМ дНТФ; 200 мкг/мл BSA; 12 мкг активированной ДНКазой ДНК из тимуса теленка и 0,036 мкМ дигоксигенин-дУТФ.

Образцы инкубируют в течение 30 мин при 72°С, реакцию останавливают, добавляя 2 мкл 0,5 М ЭДТА, и пробирки помещают на лед. После добавления 8 мкл 5 М NaCl и 150 мкл этанола (предварительно охлажденного до -20°С) ДНК осаждают, инкубируя в течение 15 мин на льду, и осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 13000 об/мин и 4°С. Осадок промывают 100 мкл 70% этанола (предварительно охлажденного до -20°С) и 0,2 М NaCl, снова центрифугируют и сушат под вакуумом. Осадок растворяют в 50 мкл Трис-ЭДТА (10 мМ/0,1 мМ; рН 7,5). 5 мкл образца помещают в лунку белого планшета для микротитрования с дном из нейлоновой мембраны (Pall Filtrationstechnik GmbH, Dreieich, FRG, продукт №SM045BWP), ДНК фиксируют на мембране, прогревая в течение 10 мин при 70°С. Лунки, содержащие ДНК, заполняют 100 мкл профильтрованного через 0,45 мкм фильтр 1% блокирующего раствора (100 мМ малеиновой кислоты, 150 мМ NaCl, 1% (вес./об.) казеина, рН 7,5). Все последующие стадии инкубации осуществляют при комнатной температуре. После инкубации в течение 2 мин раствор отсасывают через мембрану с помощью подходящего вакуумного многоканального коллектора при давлении -0,4 бар. После повторения стадии промывки лунки заполняют 100 мкл антидигоксигенин-АР, Fab-фрагментами в разбавлении 1:10000 (Boehringer Mannheim, FRG, №1093274, разбавленными указанным выше блокирующим раствором. После инкубации в течение 2 мин и отсасывания эту стадию повторяют еще раз. Лунки дважды промывают под вакуумом 200 мкл промывочного буфера 1 (100 мМ малеиновой кислоты, 150 мМ NaCl, 0,3% (об./об.) Tween^TM 20, рН 7,5). После дополнительных двух промывок под вакуумом 200 мкл промывочного буфера 2 (10 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, 50 мМ MgCl₂, pH 9,5) в лунки добавляют 50 мкл CSPD^TM (Boehringer Mannheim, №1655884), разбавленного 1:100 промывочным буфером 2, который служит хемилюминесцентным субстратом для щелочной фосфатазы, и планшет для микротитрования инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем раствор отсасывают через мембрану и после 10 мин дополнительного инкубирования при комнатной температуре количество о.е./с (относительных единиц в секунду) регистрируют с помощью люминометра, например MicroLumat LB 96P (EG&G Berthold, Wildbad, FRG).

С помощью серийных разбавлений Taq-ДНК-полимеразы строят калибровочную кривую, в которой линейный участок служит стандартом для определения активности подлежащей анализу ДНК-полимеразы.

ПРИМЕР 4

Определение обратно-транскрптазной активности

Обратно-транскриптазную активность измеряли, используя дТ праймированную поли-А-матрицу, с помощью включения либо ³²Р-дТТФ, либо меченного дигоксигенином дУТФ в комплементарную цепь. Включение ³²Р-дТТФ определяли в смеси, содержащей 1 мгк поли-А (дТ)₁₅, 500 мкМ дТТФ, 100 мг/мл BSA, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,5, 20 мМ KCl, 0,5-10 мМ MgCl₂ или 0,1-5 мМ MnCl₂, 10 мМ ДТЭ, 0,5 мкл ³²Р-дТТФ (10 мМ Ки/мл, 3000 Ки/ммоль) и различные количества ДНК-полимеразы. Инкубацию проводили при температуре 50°С. Включенную радиоактивность определяли, как было описано в анализе для определения ДНК-полимеразной активности.

Включение дигоксигенин-дУТФ определяли в смеси, содержащей 1 мгк поли-А (дТ)₁₅, 330 мкМ дТТФ, 0,36 мкМ дигоксигенин-дУТФ, 200 мг/мл BSA, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,5, 20 мМ KCl, 0,5-10 мМ MgCl₂ или 0,1-5 мМ MnCl₂, 10 мМ ДТЭ и различные количества ДНК-полимеразы. Инкубацию проводили при температуре 50°С. Включенную радиоактивность определяли аналогично способу определения ДНК-полимеразной активности.

ПРИМЕР 5

Определение ДНК-полимеразной и обратно-транскриптазной активности in situ

Анализ полимеразной и обратно-транскриптазной активности с помощью PAGE in situ осуществляют, по существу, в соответствии с методикой, описанной Spanos А. и Hübscher U., 1983, Methods in Enzymology Vol.91, p.263-277. Некоторые небольшие, но существенные модификации исходной методики состоят в том, что ренатурацию ДДС-денатурированных полипептидов осуществляют в присутствии ионов магния (3 мМ) и дАТФ (0,5-1 мкМ) для способствования восстановлению пространственной структуры.

Вкратце, методика состоит в следующем.

После выделения полипептидов либо из сырых клеточных экстрактов, либо из очищенных образцов на денатурирующем 8% полиакриламидном геле (концентрирующий гель, 5% акриламида), который содержит 150 мкг активированной ДНК тимуса теленка на мл объема геля, гель промывают четыре раза (по 15-30 мин каждый при комнатной температуре при умеренном встряхивании) в избытке ренатурирующего буфера (Трис-HCl, 50 мМ, рН 8,4; ЭДТА, 1 мМ; 2-меркаптоэтанол, 3 мМ; KCl, 50 MM; глицерин, 5-10%) для удаления ДДС. Затем гель инкубируют в течение ночи в том же самом буфере, включающем 3 мМ MgCl₂ и 0,5-1 мкМ дАТФ при 4°С без перемешивания. Первые четыре промывки ренатурирующим буфером повторяют на следующий день. После удаления ДДС и ренатурации белков гель переносят в реакционную смесь, состоящую из Трис-HCl, 50 мМ, рН 8,4; KCl 50 мМ; ДТТ 3 мМ; MgCl₂ 7 мМ; 12 мкМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ (каждого), 8 мкМ дТТФ и 4 мкМ Диг-дУТФ, 10% (об./об.) глицерин). Гель вначале инкубируют при встряхивании при комнатной температуре (30 мин), а затем медленно нагревают вплоть до 72°С с инкрементами температуры 5°С. В каждом интервале температур синтез ДНК проводят в течение 30 мин для того, чтобы определить также полимеразную активность мезофильных контрольных полимераз. После синтеза ДНК ее переносят либо электрофоретически (0,25×ТВЕ), либо с помощью капиллярного блоттинга (15×SSC) на нейлоновые мембраны (Boehringer Mannheim) и сшивают под действием УФ. Вновь синтезированные Диг-меченные ДНК определяют в соответствии с методикой, описанной для анализа активности ДНК-полимеразы.

ПРИМЕР 6

Клонирование гена ДНК-полимеразы Anaerocellum thermophilum

Получение хромосомной ДНК из Anaerocellum thermophilum.

0,8 г биомассы Anaerocellum thermophilum суспендировали в 20 мл 1М KCl и центрифугировали. Осадок суспендировали в 4,8 мл SET-буфера (150 мМ NaCl, 15 мМ ЭДТА, рН 8,0, 60 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мкг/мкл РНКазы А), после чего добавляют 1 мл 20% SDS и 50 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Полученную смесь выдерживали при 37°С в течение 45 мин. После экстрагирования фенолом и хлороформом ДНК осаждали этанолом и растворяли в Н₂О. Таким образом получали 3,8 мг ДНК.

Амплификация специфической ДНК с помощью ПЦР.

Для амплификации гена, кодирующего ДНК-полимеразу Anaerocellum thermophilum с помощью ПЦР, конструировали два смешанных олигонуклеотида (праймер 1 и праймер 2) на основе консервативных участков ДНК-полимераз семейства А, как опубликовано Braithwaite D.К. и Ito J., 1993, Nucl. Acids Res. Vol.21, p.787-802.

Последовательность ИД №1:

Последовательность ИД №2:

ПЦР-амплификацию проводили в 100 мкл буфера, содержащего 750 нг геномной ДНК из Anaerocellum thermophilum, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 2,5 мМ MgCl₂, 50 мМ KCl, 200 мкМ дНТФ, 100 пмоль каждого праймера и 2,5 Ед. Taq-полимеразы ((Boehringer Mannheim, GmbH). Последовательность-мишень амплифицировали, вначале денатурируя при 95°С в течение 2 мин, а затем осуществляя 30 циклов при 95°С в течение 0,5 мин, 50°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин. Циклическую реакцию ПЦР осуществляли в термореакторе Perkin Elmer GenAmp 9600. Электрофорез в агарозном геле показал, что специфически амплифицировался фрагмент примерно в 1900 пар оснований. Этот фрагмент лигировали в вектор pCR^ТМII (Invitrogen) и последовательность определяли, используя циклическое секвенирование. Аминокислотная последовательность, которую определяли по данной нуклеотидной последовательности, оказалась очень близка к последовательности, известной для других ДНК полимераз, так что праймеры 3 и 4 можно было сконструировать для обратной ПЦР.

Последовательность ИД №3:

Праймер 3: 5'-САА ТТС AGG GCA GTG CTG CTG АТА ТС-3'

Последовательность ИД №4:

Праймер 4: 5'-GAG CTT CTG GGC ACT CTT TTC GCC-3'

Обратную ПЦР проводили, по существу, в соответствии с методикой, описанной Triglia Т. et al., 1988, Nucleic Acids Research Vol.16, p.8186. 5 мкг геномной ДНК из Anaerocellum thermophilum расщепляли EcoRI в соответствии с инструкциями изготовителя (Boehringer Mannheim, FRG) и обрабатывали равным объемом смеси фенол/хлороформ. Водную фазу удаляли и ДНК осаждали этанолом и собирали центрифугированием.

Для циклизации расщепленную ДНК разбавляли до концентрации 50 нг/мкл в лигирующем буфере (Boehringer Mannheim, FRG). Реакцию лигирования проводили путем добавления Т4 ДНК-лигазы (Boehringer Mannheim GmbH) в концентрации 0,2 ед/мкл и реакцию вели в течение 15 ч при 15°С. Затем лигированную ДНК осаждали этанолом и собирали центрифугированием.

ПЦР проводили в 50 мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl, рН 9,2; 16 мМ (NH₄)₂SO₄; 2,25 мМ MgCl₂; 2% (об./об.) ДМСО, 0,1% (об./об.) Tween^ТМ 20 (поли(оксиэтилен)_n-сорбитанмонолаурат), 700 нг циклической ДНК, полученной, как указано выше, 50 пмоль каждого праймера, 500 мкМ дНТФ и 0,75 мкл смеси ферментов (Expand Long Template PCR System, Boehringer Mannheim, GmbH).

Условия протекания циклов были следующие:

1 × денатурация матрицы в течение 2 мин при 92°С

Электрофорез в агарозном геле выявил специфически амплифицированный фрагмент ДНК длиной 6500 пар оснований. Этот фрагмент ДНК лигировали в вектор pCR^TMII (Invitrogen) и секвенировали. Оказалось возможным сконструировать установленные на основании данной последовательности праймеры 5 и 6, кодирующие 5'- и 3'- концы участка полимеразы соответственно. Праймер 5 содержит EclXl-сайт, а праймер 6 содержит BamHI-сайт.

ПЦР проводили в описанных выше условиях (условия обратной ПЦР), используя 750 нг геномной ДНК из Anaerocellum thermophilum в качестве матрицы.

Последовательность ИД №5:

Праймер 5: 5'-CGA ATT CGG CCG TCA TGA AAC TGG TTA TAT TCG ATG GAA АСА G-3'

Последовательность ИД №6:

Праймер 6: 5'-CGA ATT GGA TCC GTT TTG TCT CAT ACC AGT TCA GTC CTT С-3'

Клонирование и экспрессия.

Продукт ПЦР очищали с помощью электрофореза 20 мкл смеси ПЦР в 0,8% агарозном геле. Полосу 2,552 кДА участка, кодирующего полимеразу, выделяли из агарозы, экстрагируя фенолом. Затем ДНК обрабатывали хлороформом и осаждали этанолом. Осадок ресуспендировали и расщепляли EclXI и BamHI в соответствии с инструкцией изготовителя (Boehringer Mannheim, GmbH) для получения липких концов для направленного клонирования. ДНК лигировали в экспрессирующий вектор pASK75 (Biometra), который также должен быть расщеплен EclXI и BamHI. Продукты лигирования вводили в штамм LE392 pUBS520 E.Coli (Brinkmann U. et al. (1989) Gene Vol.85 p.109-114) путем трансформации. Трансформанты культивировали на L-агаре, содержащем 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина, чтобы обеспечить селекцию рекомбинантов. Колонии отбирали и выращивали в L-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина, и плазмидную ДНК получали путем щелочного лизиса. Плазмиды скринировали на предмет включения вставок, расщепляя BamHI. Рекомбинанты, содержащие вставки, выращивали в L-бульоне, содержащем ампициллин и канамицин, и тестировали на предмет экспрессии термофильной ДНК-полимеразы, индуцируя экспоненциальный рост культуры 0,2 мкг/мл ангидротетрациклина и анализируя термообработанные экстракты на ДНК-полимеразную активность, как описано выше (определение ДНК-полимеразной активности). Получали рекомбинант, экспрессирующий ДНК-полимеразу из Anaerocellum thermophilum. Этот штамм обозначали E.coli AR220 (DSM №11177) и плазмиду pAR10.

ПРИМЕР 7

ДНК-полимеразу из Anaerocellum thermophilum сравнивали с ДНК-полимеразами из Thermus thermophilus и Thermus filiformis.

Анализировали одинаковые количества (в единицах) ДНК-полимераз. Каждый фермент тестировали на ДНК-полимеразную активность, обратно-транскриптазную активность в присутствии Mg⁺⁺ (5 мМ) и обратно-транскриптазную активность в присутствии Mn⁺⁺ (1 мМ) в условиях реакции, оптимальных для отдельных ферментов. Для сравнения отношения ДНК-полимеразной активности к обратно-трансферазной активности оптическую плотность в относительных единицах (о.е.), измеренную в анализе ДНК-полимеразы, принимали за 100. Оптическую плотность, измеренную в тестах обратно-транскриптазной активности, выражали как процент от полимеразной активности. Результаты представлены на фиг.5.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены: способ амплификации ДНК, способ клонирования второй кДНК и обратной транскрипции ДНК. Каждый из способов отличается тем, что используют термостабильную ДНК-полимеразу, которая кодируется SEQ ID NO:7, происходит из Anaerocellum thermophilum или рекомбинантного штамма E.coli, трансформированного вектором, содержащим SEQ ID NO:7, ДНК-полимераза катализирует матрично-направленную полимеризацию ДНК, обладает 5'-3'-полимеразной активностью и обратно-транскриптазной активностью и не обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью в присутствии ионов магния и отсутствия ионов марганца. ДНК-полимераза сохраняет, по крайней мере, 90% своей активности после инкубации в течение 30 минут при 80°С в отсутствие стабилизирующих детергентов и обладает кажущейся молекулярной массой между приблизительно 96 кДа и приблизительно 100 кДа. Магний-зависимая обратно-транскриптазная активность ДНК-полимеразы составляет более чем 30% от ДНК-полимеразной активности, тогда как марганец - зависимая обратно-транскриптазная активность указанного полипептида составляет более чем 60% от ДНК-полимеразной активности. Использование ДНК-полимеразы обеспечивает увеличение точности транскрибирования матричной РНК при высоких температурах. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 ил.

1. Способ амплификации фрагмента ДНК из матрицы РНК или ДНК, отличающийся тем, что термостабильную ДНК-полимеразу, полученную из Anaerocellum thermophilum или из рекомбинантного штамма Е. Coli, трансформированного вектором, содержащим SEQ ID NO:7, добавляют к матрице РНК или ДНК, которую необходимо амплифицировать, в присутствии двух олигонуклеотидов, специфичных в отношении последовательности, где указанная полимераза катализирует матрично-направленную полимеризацию ДНК, обладает 5'-3'-полимеразной активностью и обратно-транскриптазной активностью и не обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью в присутствии ионов магния и в отсутствии ионов марганца.2. Способ клонирования второй кДНК и секвенирования РНК, отличающийся тем, что термостабильную ДНК-полимеразу, полученную из Anaerocellum thermophilum или из рекомбинантного штамма Е. Coli, трансформированного вектором, содержащим SEQ ID NO:7, добавляют к матрице РНК, которую необходимо транскрибировать и секвенировать, в присутствии, по меньшей мере, одного праймера, дезоксинуклеотидов и дидезоксинуклеотидов, причем праймеры или дезоксинуклеотиды и дидезоксинуклеотиды являются меченными, где указанная полимераза катализирует матрично-направленную полимеризацию ДНК, обладает 5'-3'-полимеразной активностью и обратно-транскриптазной активностью и не обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью в присутствии ионов магния и в отсутствии ионов марганца.3. Способ обратной транскрипции, отличающийся тем, что термостабильную ДНК-полимеразу, полученную из Anaerocellum thermophilum или из рекомбинантного штамма Е. Coli, трансформированного вектором, содержащим SEQ ID NO:7, добавляют к матрице мРНК, которую необходимо транскрибировать в ДНК, в присутствии одного праймера, где указанная полимераза катализирует матрично-направленную полимеризацию ДНК, обладает 5'-3'-полимеразной активностью и обратно-транскриптазной активностью и не обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью в присутствии ионов магния и в отсутствии ионов марганца.4. Способ по любому из пп.1-3, где указанная полимераза проявляет Mg²⁺-зависимую обратно-транскриптазную активность, составляющую более 30% по отношению к ДНК-полимеразной активности, принятой за 100%.5. Способ по любому из пп.1-3, где указанная полимераза проявляет Mn²⁺-зависимую обратно-транскриптазную активность, составляющую более 60% по отношению к ДНК-полимеразной активности, принятой за 100%.6. Способ по любому из пп.1-3, где указанная полимераза обладает кажущейся молекулярной массой между приблизительно 96000 и приблизительно 100000 Дальтон.7. Способ по любому из пп.1-3, где указанный трансформированный рекомбинантный штамм Е. Coli представляет собой Е. Coli LE392pUBS520pAR10 (DSM 11177).