Способ получения препарата внутриклеточной глюкозоизомеразы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/92 C12N1/04 

О

;п

4: Х 11 Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности, а именно к способу получения внутриклеточной глюкозоизоме разы. Известен способа-получения внутриклеточной глюкоаоизомеразы из микроорганизмов рода Mreptomyces путем обработки культуральной жидкости глутаровым альдегидом, фильтрации и сушки lj . Недостатками данного способа являются относительно невысокая удельная активность препарата глюкозоизомеразы, так как препарат со.держит большое количество балластных веществ микробной клетки, а также потеря части активности из-за диффузионных затруднений, возникающих при прохождении субстрата через неповрежденную клеточнзш стенку. Наиболее близким к изобретению по технической сути является способ получения препарата внутриклеточной глюкозойзомеразы, предусматривающий отделение клеток, микроорганизмов рода Bacillus, их разрушение механическим путем или автолизом на 25-100 смешивание с глутаровым, альдегидом, взятым в количестве 0,1-1,0 мае.ч. на 1 мае,ч. сухих веществ клеточной Maccbf, вьщерживание смеси при температуре окружающей среды до образования геля, получение гранул и их И . Целью изобретения является повьше ние удельной активности препарата внутриклеточной глюкозоизомеразы и получение препарата, не содержащег растворимых микробных веществ. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения препарата внутриклеточной глюкозоизомеразы, предусматривающему отделе ние клеток микроорганизмов, их разру шение автолизом, добавление глутарового альдегида, получение гранул и их сушку, в качестве продуцента используют штамм Actinomyces alBog- riseolus 28-3, при этом автолиз клеток микроорганизмов проводят в 0,010,10%-ном растворе детергента при 65-73 С в течение 0,5-2,0 ч, нерастворимый осадок автолизированных клеток концентрируют до 3-30% сухих веществ, в концентрат добавляют 10-40% от сухих веществ концентрата пищево го белка, а получ нные гранулы под8сушивают до 50-70% сухих веществ и подвергают дублению глутаровым альдегидом, взятым в концентрации 0,2-t,0%. Способ осуществляют следующим образом. Клетки микроорганизмов, например, Actinoinyces alborRiscolus 28-3, отделяют от культуральной жидкости и промывают, а затем вносят в количестве 1-5% по сухим веществам в нагретый до 65-75с 0,01-0,10%-ный раствор детергента, имеющий рН ,8 и содержащий 51СТ М хлористого кобальта. Суспензию вьщерживают 0,52,0 ч при указанной температуре, затем охлаждают до температуры окружающей среды, отфильтровьшают и промывают нерастворимый остаток, представляющий собой концентрат глюкозоизомеразы. При этом происходит потеря до 60% сухих веществ клеток, а удельная глюкозоизомеразная активность достигает 250-270% от активности исходных клеток, причем наблюдается увеличение кажущейся активг ности (до fO%) за счет уменьшения диффузионных затруднений для действия субстрата. Потери глюкозоизомеразной активности с раствором и промывными водами не превьш1ают 1%. К концентрату глюкозоизомеразы с содержанием 3-30% сухих веществ прибавляют пищевой белок (желатин) в количестве 10- 40% по сухим веществам концентрата, (белок может быть прибавлен в виде раствора) .Смесь тщательно перемешивают Л гранулируют а затем полученные гранулы подсушивают до 50-70% сухих веществ. К охлажденному до 4-6°С раствору глутарового альдегида, имеющему рН 6,3-7,2 прибавляют подсушенные грзнулы и вьщерживают не менее 3 ч при указанной температуре для дубления, а затем с тфильтровывают и сушат полученный препарат. За единицу глюкозоизомеразной активности (ГиА) принимается количество фермента, которое катализирует превращение 1 |UM субстрата в продукт за минуту при 7рс, рН 7,0 концентрации субстрата (о-фруктозы) 2 М, содержании ионов магния 51(. Пример 1, (контроль). 81,8 г влажной биомассы Actinoipyces albop,riscolus 28-3 (ГиА 350 ед/г СВ, В 95,30, где В - массовая доля влаги %), подвергают автолизу при 25с

J11252484

в течение 5 ч (57% ГиА в растворе),еще 1,5 л (И промывка) и, наконец,

затем прибавляют 6,4 г 25%-ного двумя порциями воды по 1 л (Ш

вора глутарового альдегида и 1У промывки), В промывных водах

(0,42 мае.ч на 1 мае.ч. сухого ве-определяют оптическую плотность при

щества клеточной массы). Через 1,5 ч j280 и 260 им, чтобы оценить содержаобразовавшийся гель экструдируют икие в препарате легко вымываемых вевысушивают полученные гранулы на воз-ществ - компонентйв микробной клетки,

духе.в частности, содержание белка и

Полученные 7,7 г препарата промы-нуклеиновых кислот. Результаты опыта

вают 1,5 л воды (1 промывка) затем joприведены в табл.1.

Т а б л и ц а 1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ, . предусматривающий отделение клеток дакpoopгaйизмoв, их разрушение автолизом, добавление глутарового альдегида, получение гранул и их сзпнку, отличающ и и с я тем, что, с целью повьшения удельной активности препарата и получения препарата, не содержащего растворимык микробных веществ, в качестве продуцента используют штамм Actinomyces albogriscQlus 28-3, при этом автолиз клеток микроорганизмов проводят в 0,01-0,10%-ном растворе детергента 65-75 С в течение 0,5-2,0 ч, нераствориьв 1й остаток автолизованных клеток концентрируют до 3-30% сухих веществ, в концентрат добавляют 10-40% от сухих веществ концентрата пищевого белка, a полученные гранулы подсушивают до 50г 70% сухих веществ и подвергают дуб лению глутаровым альдегидом взятым в концентрации 0,2-1,0%.

Содержание белка,

мг/л16О

Содержание нуклеиновых

кислот, мг/л1О Примечаниеr Е2 -оптические плотности растворов при 280 , и 260 нм соответственно в кювете длиной 1 см.

После проьв 1вки получено г препарата (В 13,2%), при этом потеря массы при промывке 39%. Активность полученного образца 75 ед / г сухого вещества , что составляет 23% от F заданной активности-.

М - масса СВ автолизованных клеток в процентах от Максимальная потеря активности из-за перехода части фермента в рас воримое состояние наблюдается при обработке биомассы О,10%-ным раство ром цетилпиридинийхлорида и составляет соответственно 3% (60 мин) и 4Z (120 мин). В остальных случаях активность в растворе не превьшает t% от заданной. Обработка 0,03%-ным раствором додецилсульфата натрия в течение Т20 мин приводит к кажущемуся увеличению активности на по сравнению с заданной. Получение препарата внутриклеточ ной глюкозоизомеразы. К 246 г нерастворимого остатка, полученного после автолиза в 0,0f% ном растворе детилпиридинийхлорида в течение 1 ч (ГиА 378 ед/г СВ, В 97,0%) прибавляют 10 г 10%-ного раствора желатина (0,12 мае,ч. на 1 мае.ч. СВ нерастворимого остатка) перемешивают до гомогенного состояния и получают гранулы экструзией. Гранулы подсушивают до 50% СВ при , а затем помещают в 100 мл

Полученный препарат обладает низкой глюкозоизомеразной активностью и имеет большое количество растворимых веществ , для удаления которых требуется многократная промьюка (не менее 0,6 л воды на I г препарата;. охлажденного до 1%-ного раствора глутарового альдегида, вьщерживают 3 ч при 5с, а затем отфильтровывают и промывают 0,5 л воды (1 промывка) и еще гремя порциями воды по 100 мл №,Ш и 1У промывки). В промывных водах определяют Е, и Е,,, / V .-260 оО (см.табл.1). Как видно из результатов, уже после И промывки в растворе отсутствуют белки и нуклеиновые кислоты (объем промывных вод не более 0,06 л на t г препарата). После сушки на воздухе при 25С получено 9,2 г препарата (В 13,0%), при зтом потеря массы составляет около 5% от исходных сухих веществ. Активность препарата 245 ед/г СВ, что составляет 70% от заданной в концентрате глюкозоизомеразы и 82% от активности исходных клеток. Пример 3. Проведение автолиза клеток Actinomyces albop,riseolus 28-3. К 1800 мл О,10%-ного раствора додецилсульфата натрия, нагретого до 75С и содержащего М хлористого

, Пример 2,Проведение автолиза клеток Actinomyces albogriseolus 28-3.

К 1800 мл раствора детергента XtiH 6,3), нагретого до 65°С и содер ащего хлористого кобальта, .лрибавляют влажную биомассу (В 94,8% ГиА 300 ед/г сухого вещества), переДетилпиридинийхлорида0,040,03

378

75

47

670

500

заданной в исходной биомассе (по СВ).

кобальта, прибавляют 200 г влажной биомассы (В 97,0%, ГиА 300 ед/г СВ) , перемешивают и выдерживают 0,5 ч 35 при 75с, а затем отфильтровывают нерастворимый остаток и промывают его двумя объемами воды. Активность полученного концентрата глюкозоизомеразы 400 ед/г СВ,,получено 45 г (В 90,0 % 40 потеря массы 25%),

Получение препарата внутриклеточной глюкозоизомеразы..

К 45 г концентрата глюкозоизомеразы прибавляют 10 мл раствора желатина содержащего 0,45 г СВ (0,1 мае.ч. на 1 мае.ч. СВ концентрата), тщательно перемешивают охлаждают до 5С и гран: лируют.

Гранулы подсушивают до 70% СБи поме- щают в 50 мл 0,2%-яого раствора глутарового альдегида, имеющего рН 6,5. После выдерживания в течение 12ч дри 5 С гранулы отфильтровьшают, промывают 0,2 л-воды и сушат на 55 воздухе.

Получено 5,5 г препарата (В 14,1%) ГиА 287 ед/г СВ), выход от заданной

мешивают и помещают в термостат при 65®С на определенное время.. Затем (5ыстро охлаждают и отфильтровывают нерастворимый остаток, его промывают 5 двумя объемами воды., и определяют массу, ГиА и содержание сухих веществ В). Результатыопыта приведены в табл.2.

Таблица2

0,10

670

45 42 45 620

активности 75%, выход от активности исходных клеток 96%.

Пример 4. Для автолиза в О,03%-ном растворе додецилсульфата натрия при 7сРс берут 200 г влажной биомассы Actinomyces.albogviseolus 28-3 (В 70,0%, ГиА 260 ед/гСВ) на 1800 МП раствора детергента и проводят автолиз в течение 2 ч. Получено 95,8 г концентрата глюкозоизомеразы (В 70,0%) с ГиА 716 ед/г СВ,

К полученному концентрату глюкозоизомеразы прибавляют мл раствора желатина, содержащего 9,6 г СВ . (0,4 мас.ч. на 1 мас.ч. СВ концентрата), перемешивают и гранулируют. Гранулы подсушивают до 60,0% СВ при 25 С, а затем,их прдвер17ают , нию в 250 мл 0,4%-ного раствора глутарового альдегида при 5°С в течение З ч.

После промывки и сушки на воздухе получено 39,5 г препарата глюкозоизо- меразы (В 15,0%), ГиА 383 ед/г СВ, что составляет 75% от заданной актив9ности и 1471 от активности биомассы, исходной Снижение температуры приводит к 112524810 большим Потерям активности глюкозоизомеразы в результате перехода части фермента в раствор. Увеличение темпе75

ратуры выше 75®С приводит к частичной ,инактивации глюкозоиэомеразы (табл.3).

Таблица 3

23

Контроль

23 57 Гранулы частично разрушаются при попадании в раствор глутарового альдегида

Обработка детергентом клеток

2,0 - 620 42 3 ДДС 75 0,5 10,0 400 75 ,0,10

4ДДС ;

(0,03) 70 2,0 25,0 716

Механическую прочность оценивают визуально по наличию или отсутствию мути, 3 ч инкубации при перемешивании при 70 С;+44 механически прочный (без мути) распадается)..

дас - додецилсульфат натрия, ЦПХ - цетилпиридинийхлорид.

. Таким образом, предлагаемый способ55 по известному способу, а также сокрапозволяет получить препарат внутри- тить количество легко вымываемых растклеточной глкжозоизомеразы с актив- воримых веществ микробной клетки ностью в четыре раза больше, чем в 7-8 раз.

207

87 100 133

to

40

275

110

40

0,2

287 75

60

0,4 +++

383 82

60

0,6 ++-f

212 35 образукяцейся в механически

При получении препарата глйкозо.игтюмеразы предлагаемым способом мо|жет быть использована биомасса продуцентов, обладакицих более низким

Продолжение табл.З

72

96

блажные гранулы

после дубления непрочны

147

120

11% потери активности в раст вор

t.

25

15% инактивации под действием высокой температуры обработки клеток

До 8% активности в растворе

Инактивация Инактивация

уровнем глюкозоизомеразной активности/ чем зто необходимо для получения як-гтивного препарата, что позвсхляет , расширить ассортимент микроорга результате 30 мин кипячения гранул препарата или в езульта:тё прочный (слабая муть ,+ механически непрочный (до 30% гранул

17112524818

низмов - продуцентов глюкозоизо-глюкозоизомеразы и глюкозо-фруктозмеразы .ных сиропов - полноценных заменитеПредпагаегшй способ позвопявтлей свекловичного сахара из крахма организовать производство препаратдлопродуктов.