Способ получения конъюгата иммуноглобулина с пероксидазой Советский патент 1984 года по МПК A61K38/44 A61K39/395 

сг

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения реагента для иммуноферментного анализа - конъюгата иммуноглобулина и пёроксидазы для использования его в диаг ностике различных заболеваний.Метод ИФА применяют для определения антител различных антигенов, гаптенов, лекарственных препаратов, наркотиков и др. биологически активных веществ.

Известен способ получения конъюгата из иммуноглобулина и пероксидазы с помощью глутаральдегида, з.аключающийся во взаимодействии пероксидазы и иммуноглобулина в присутствии 0,05% глутаральдегида в фосфатном «уфере, рН 6,8, с последукяцим дигшизом СИ.-.

Недостатком способа является недостаточно высокая активность получаемого конъюгата, в результате чего он может быть использован в ИФА только при разведении 1: SOO-l: 1000 .

Активность конъюгата может зависеть от степени связывания пероксидазы с иммуноглобулином и от серологической активности иммуноглобулина. Невысокая активность коньюгата является по всей видимости следствием того, что полученный коньюгат имеет низкое содержание пероксидазы - не более 1%.

99% пероксидазы, очень дорогого фермента, не связывается с иммуноглобулином. Кроме этого, для получения высокоактивных коньюгатов обычно используют иммуноглобулин, полученный с помощью иммуносорбента. Для этого сыворотку пропускают через колонку с иммуносорбентом, антитела |Элюируют с колонки с помощью 0,1М .глицин-HCt буфера рН 2,3. Затем полу ченный иммуноглобулин диализуют против буферной системы с рН 6,8 или нейтрализуют, добавляя . Концентрация иммуноглобулина для получения коньюгата должна быть не ниже чем 10 мг/мл, при такой концентрации препарата при нейтральном рН обычно 50% иммуноглобулина выпадает в осадок, который можно растворить изменив рН до 2,3.

I

Цель изобретения - повышение актиности коньюгата. I

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения конью гата иммуноглобулина с пероксидазой, предусматривающему взаимодействие иммуног лобулина с пероксидазой в присутствии 0,05% глутаральдегида с последующим диализом, процесс взаимо действия иммуноглобулина с пероксидазой осуществляют в буферной системе, содержащей глицин, при рН 3,0 5,7, а после диализа реакционную смесь дополнительно обрабатывают

глутаральдегидом, взятым в количест ве 0,20 - 0,25%.

Предлагаемый способ позволяет повысить долю связываемой с иммуноглобулином пероксидазы, эффективнее использовать исходный иммуноглЬбулин так как ведение процесса при более кислых значениях рН на первой стадии обуславливают его большую растворимость, устойчивость к осаждению. Это в конечном счете, влияет на улучшение свойств, активность целевого продукта, что позволяет использовать последний при ИФА в значительно больших разведениях, чем препарат, полученный по известному способу.

Пример. Для получения коньюгата используют три ингредиента: иммуноглобулин (антииммуноглобулин мыши, антииммуноглобулин человека, антииммуноглобулин кролика), пероксидазу, выделенную из хрена с Р 3,0, и альдегид глутаровой кислоты (25%) . Иммуноглобулин получают с помощью иммуносорбентов, сенсибилизированных предварительно иммуноглобулинами кролика, мыши, человека. Для снятия с колонки иммуноглобулинов используют 0,1М глицин-НСй. буфер (рН 2;3).

Полученный препарат иммуноглобулина концентрируют до 10 . Затем 0,5 мл (с концентрацией не ниже 5 мг) в растворе 0,1 М глицин-НСббуфера (рН 2,3) прибавляют к раствору (0,5 мл) пероксидазы (12 мг) в 0,1М фосфатном буфере (рН 6,8), полученный раствор смеси приобретает рН 5,7, затем добавляют 0,05 мл 1%-ного раствора глутаральдегида, реакция идет при комнатной температуре в течение 2 ч, затем проводят диализ против 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,2). Этот буфер содержит следующие соли: 0,15 М NaCE ,, 0,003 М KCi, 0,003 М MgCt . После диализа вновь добавляют альдегид глутаровой кислоты - 0,05 мл 5%-ного раствора (конечная концентрация глутаральдегида 0,25%), Реакция идет так же, как и в первый раз, в течение 2 ч, затем проводят диализ 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,2). Препарат коньюгата хранится как в жидком виде при 4°С, так и в лиофильно высушенном. Коньюгат, полученный этим способом, используют в ИФА при разведении 1:6000 - 1:24000, а процент связанной с иммуноглобулином пероксидазы равен 10 - 15%.

Сравнительное изучение активности коньюгатов, полученных известным способом и при использовании пероксидаз и иммуноглобулина одной и той же серии, представлено в табл. 1 и 2.

Как видно из данных табл. 1 и 2, при двукратном добавлении глутаральдегида активность кон югата возрастает, об этом свидетельствует и увеличение процента связанной пероксидазы с иммуноглобулином и увеличение объема разведения при использовании его в ИФА. Увеличение объема разведения коньюгата дает фозможность значительно снизить стоимость прове- .дения ИФА, где коньюгат является самым дорогим ингредиентом. гпо об .| Предлагаемый: Известный (литературные дан Способ Пpeдлaгae ый Известный То же (литературны данные)

Способ получения глутаральдегидного коньюгата дает возможность получить более активный препарат коньюгата и позволяет полнос ью использовать препарат иммуноглобулина без 50% отхода. Полученный препарат коньюгата Jlыдepживaeт хранение в растворе и сушку без применения бычьего сыворото 1ного альбумина. ая пероксддаза. Разведение коньюгата %при использовании его 121:12000 0,8.1:1600 больше 1,01:500-1:000 Разведение коньюгата при использовании в ИФА при добавлении глутаральдегида до концентрации 1:100 1:200 1:12000 1:2400 1:16001:2000 1:500 - 1:1000 Таблица 1 .в ИФА .Таблица 2 0.05 % 1 0,25 % рН 3,0

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА ИММУНОГЛОБУЛИНА С ПЕРОКСИДАЗОЙ, предусматрива101,ий их взаимодействие в присутствии 0,05% глутаральдегида с последующим диализом, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, процесс взаимодействия иммуноглобули на с пероксидазой осуществляют в буферной системе, содержащей глицин, при рН 3,0 - 5,7, а после диализа реакционную смесь дополнительно обрабатывают глутаральдегидом, взятым в количестве 0,20 - 0,25 %.