Способ получения 3-0/ @ - @ -глукуронпиранозил/-соясапогенола Советский патент 1984 года по МПК C12P7/00 

1

4ii 4;

О 00

Изобретение оуносится к KHMHIJOфармацевтической прокышленности и . касается производства терапевтических средств, которые могут быть использованы в медицине при аутоиммунных и равматических заболеваниях.

Предложенный способ новый, в патентной и научно-.технической литературе-не описан.

Целью изобретения является получение 3-0 (р-О-глукуронпиранозил)соясапогенола Bfc

Способ получения 3-0. (p-D-глукуронпиранозил)-саясапогенола В общей формулы .

-ОН

заключается в том, что микроорганизм Stachybotrys sp. штамм Т-791 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники азота и углерода, минеральные соли и следы микроэлементов, при рН 3,511,5 и температуре 15-38°С с последующим выделением целевого продукта из культуральной среды и при необходимости переводят в соль.

Штамм Stachybotrys sp. Т-791 для получения предложенного соединения бал вьвделен из почвы в Tokushima City, Tokushiraa, Japan.

Штамм Stachybotrys sp. T-791 хранится в научно-исследовательском институте ферментации Agency of Industrial Science and Technology, Japan (N 8-1 Inaga Higashi Schome, Chiba-shi, Japan, под депозитным номером FSRm-p 3803, a также в Американском собрании типов культур 12301 Park lawn Drive Rockville, Maryland 20852 - под номером АТСС 20513).

Культуральные признаки.

Солодовый экстракт агара.

Рост быстрый и неравномерный. Субстратный мицелий от рыжевато-коричневого до темно-коричневого. Колония плоская, образование конидий хорошее. Цвет гиф от светло-коричневого до рыжевато-коричневого, наблюдаются капельки жидкости, которая вьвделяется. Растворимый пигмент не продуцируется.

Картофельная глюкозная среда. Рост очень быстрый и при выращивании при в течение 30 дней колония достигает размера 70 мм. Периферическая часть колонии вытянута древовидно, наблюдаются прикрепленные к субстрату белые гифы. Видно большое количество мелких капелек жидкости. Субстратный мицелий светло-желтый. Растворимый пигмент не образуется.

Агаровая среда Чапека.

Рост колонии слабый.

Синтетическая слизистая агаровая среда. :

Рост колонии слабый.

Агаровая среда на овсяной муке.

Рост колонии очень хороший . Колония тонкая и плоская. Образование гиф обильное от начальной стадии выращивания, конидии образуются также быстро. Цвет колонии изменяется от белого до темно-коричневого в процессе культивирования. Большое, количество жидких капелек появляется на гйфе1х. Растворилйлй пигмент не образуется.

Морфологические свойства.

Фиалофоры просто разветвлены и стоят прямо. Фиалофорные окончания слегка уто.71щены в виде розги. Однако утолщение незначительно. Эти штаммы имеют гифы шириной 4,0 - 4,5 микрон, что несколько превышает ширину фиалрфор. Фиалофоры, которые прямо ответвляются с опорными клетками от вегетативных, или от воздушных гиф, имеют от двух до трех перегородок и размеры 40-80-3,0-3,5 микон. Клеточная стенка фиалофор не мeJjкoигoльчaтaя, а гладкая. От трех до шести фиалид отходят от утолщенной части окончаний фиалофор. Кроме того, сферические и имеющие форму сплюснутых шариков Фиалофоры одной клетки, имеющие мелкоигольчатый выступ и размеры 4,3-5,2 3,0-4,2 микрон, постоянно образуются безипетально от окончания фиалид, формируется цепочка конидий от 24 до 70 штук. Фиалида имеет обратную булавовидную форму и размеры 6,9-10, З, 5-4,7 микрон. Фиал Офоры и фиалиа бесцветны, а фиалида окрашена в цвет от кофейного до черного.

Физиологические свойства.

Stachybotrys sp. T-791 является аэробным штаммом.

Условия выращивания: рН 3,5-11,5, темп 15-38с. Оптимум роста: рН 4,99,5, температура 20-30С.

Получают 3-0 (3-О-глукуронпиранозил) - соясапогенол В следующим образом.

Сначала штамм Stachybotrys sp. T-791 выращивают в питательной среде, содержащей обычные источники питания и добавки. В качестве питательного субстрата обычно используются источники азота, например соевая мука, соевое масло, экстракт от замачивания зерновых, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, толокно. мясной экстракт, гидролизовэнный казеин, соли аммония и нитраты. Под ходящими источниками углерода являются глюкоза, глицеролмальтоза, кра мал, лактоз,а, сахароза и меласса. Добавки к культуральной среде жат такие вещества как карбонат кальция, хлорид кальция,сульфат ма ния и фосфорнук) кцслот. Если необходимо, то культуральная среда может содержать очень маленькие добав ки солей металлов, таких как железо, медь, магний и цинк. Выращивание проводят в обычной водной среде содержащей упомянутый субстрат, с, использованием поверхностного или глубинного культивирования с аэраци ей и перемешиванием. Предпочтительно глубинное вьфащивание с аэрацией и перемешиванием. Культивирование проводят при 15 - 38°С, предпочтительно при 2032°С, в течение 3-7 дней в условиях обычной аэр|ации и при поддержа нии культуральной среды 3,5 11,5, предпочтительно 4-,5 - 9,5, По завершении выращивания полученное вещест во выделяют из питател нйй среды различными известньлш .методами. Вьшелени€ может быть осуществлено, например, методом, использующим различия в растворимости продуктами и примесями, или методом, использующим различие в адсорбционной способности и средстве с ойачныки абсорбентами, такикм как активированный уголь ХАД-2 силикагель, ионообменные смолы, сефадекс и т.п., или методом, использующим различия в коэффициенте распределения между двумя жидкими фаза ми, и Сочетанием таких методов. Соединение может быть получено в виде солей с различными фармгщевтически приемлемыми основаниями. Соединения могут бытв использоваиы .как терапевтические средства .при нефритах, В этом случае они могут быть в виде фармацевтических составов и вместе с обычными фармацевтически приемлемыми носителями. Подходящими носителями, которые могут быть использованы, являются, на пвимер, разбавители или наполнител наполнители для увеличения объема, связующие и смачивающие агенты, дез.интеграторы, поверхностно-активные вацестда и смазки, которяе обычно применяются для приготовления таких лекарств, в зависимости от дозированной форки. Различные дозированные форьы терапевтических агентов для лечен и я « нефритов можно выбрать в соответств с целями лечения. Дозированными формами, которые могут быть использованы, являются таблетки, пилюли. порошки, жидкие препараты, суспензии, эмульсии, гранулы, капсулы, суппозитории и препараты для инъекции (растворы, эмульсии, суспензии и тому подобное). При приготовлении фармацевтического состава, содержащего соединения согласно изобретению и в качестве активного ингредиента, ю форме таблеток может быть использован широкий спектр носителей, известных в данной области. Подходящими носителями, являются лактоза, белый сахар, хлористый натрий, глюкоза, мочевина, крахмал, углекислый кальций, каоли.н, кристаллическая целлюлоза, кремниевая кислота, связующие, такие как вода, этанол, пропанол, простой сироп, глюкоза, раствор крахмала, раствор желатина, карбоксиметилцеллюлоза, метйлцеллюлоза, фосфат калия и поливинилпирроллидон, дезинтеграторы, такие как сухой крахмал, альгинат натрия, порошок агара, порошок ламинарии, кислый карбонат натрия, карбсжат кальция, твин, лаурилсульфат натрия, моноглицерид стеариновой кислоты, крахмал и лактоза, ингибиторы дезинтеграции, такие как белый сахар, глицериловый эфир, стеариновой кислоты, масло какао и гидрогенизированные масла, промоторы абсоцзбции, такие как че.твертичные основания аммония и лаурил;сульфат натрия, увлажнители, такие как глицерин и крахмал, адсорбенты, такие как крахмал, лактоза каолин, бентонит и кколлиодная кремниевая кислота и смазки, такие как очищенный тальк, соли стеариновой кислоты, порошок борной кислоты, мак- роголь и твердый полиэтиленгликоль. При прессовании фармацевтического состава в Форме пилюли могут быть использованы самые разнообразные обычные известные носители. Подходящими носителями являются, глюкоза, лактоза, крахмал, масло какао, твердеющие растительные масла, каолин, тальк, связующие, такие как порошок аравийской камеди, порошок трагаканта, желатин и этанол и дезинтеграторы, такие как ламинария -и агар. Таблетки при желании могут быть покрыты одним, двумя и более слоями например покрытые сахаром таблетки, с желатиновым покрытием, пленочным покрытием и таблетки с покрытием, растворимым в кишечнике. При прессовании фармацевтического состава в суппозитории могут быть использованы разнообразные носители, известные в технике. Подходящими носителями являются полиэтиленгликоль, масло какао, высшие спирты, эФиры высших спиртов, желатин и полусинтётические глицериды. Если фармацевтический состав гот вят .в форме препарата для инъекции, то полученный раствор и суспензию стерилизуют, они должны быть изотоническими, по отношению к Крови, Пр приготовлении фармацевтического сос тава в форме раствора или суспензии могут быть использованы все известные разбавители, Подходящими разбавителями являются вода, этиловый спирт, пропиленгликоль, этоксилированный изостеариловый спирт, сорбит полиоксиэтилена и эфиры сорбитана. Хлористый натрий, глюкоза или глице рол могут быть введены в терапевтический препарат для лечения нефрита в количестве, достаточном для получения изотонического раствора. Тера певтический препарат может содержат вспомогательные средства для раство рения, буферы, болеутоляющие агенты и противостарители и что также возможно, красящие агенты, ароматичес кие, вкусовые, освежающие и другие вещества. Количество соединения, вводимого в качестве активного ингредиента в фармацевтический состав препарата для.лечения нефрита, не лимитируется и может варьироваться в широких пределах. Подходящим терапевтически эффективным количеством соединения обычно является 1-70 вес.%, предпочтительно 5-50 в-ес.% от всего состава. Антикомплементарный агент/ напри мер при лечении нефрита, в лечебный препарат мйжет вводиться различными путями, приемлемыми в зависи-мости от формы лекарственного препарата. Например, таблетки, пиллюли, жидкие препараты, суспензии, эмульсии, гранулы, капсулы вводят через рот. Препараты для Инъекции вводят внутривенно, либо один, либо вместе с вспомогательными агентами, обычными в таких случаях, например с глюкозой и аминокислотами. Кроме того, если необходимо, лекарственный препарат может быть введен внутримышечно, подкожно, внутрибрюшинно внутрикожно. Суппозитории вводят интраректально. Дозу препарата при лечении нефрита выбирают в зависимости от цели ле чения, симптоматики и т.п. Обычно применяют дозу соединения 0,520 мг/кг веса тела в день. Соединения обладают антикомплемен тарной активностью и используются в качестве лечебных средств при аутоиммунных заболеваниях, болезнях koллaгeнa и ревматических заболеваниях. Фармакологические испытания. Испытываемые соединения. А 3-0-(р-П-глукуронпиранозил)-соясапогенол В. В Глицирризин (соединение для сравнения) « Антикомплементарная активность. АНтикомплементарную активность определяют следующим образом. В пробирку загружают по 0,5 мл водной дисперсии каждого из испытываемых соединений, по 0,5 мл сенсибилизированных эритроцитов „(СЭ) , пЕ)и этом культура содержит 1 10°клеток/1 мл пятикратно разбавленного буферного раствора веронала, содержащего изотонический елатин (этот пятикратно разбавленный раствор для краткости назван ЖВБ) и по 0,5 мл комплемента сыворотки (комплемент морских свинок), разбавленного 150 раз ЖВБ. смесь вцдерживают при в течение 60 мин. Затем к Ней добавляют 5 мл ледяного физиологического раствора и центрифугируют. Спектральная поглотительная способность отдельного верхнего слоя определяется при ОП 413, измеряется степень ингибирования гемолиза сенсибизированных эритроцитов испытываекими соединениями. Значение ингибирующей гемолиз активности (у/мл), измеренное описанным методом, показано в табл. 1 для каждого испытываемого соединения. Острая токсичность. Острая токсичность (ЗЩ мг/кг ве-; са) испытываемых соединений была определена на мышах при внутрибрюшинном введении соединения А и при внутривенном введении соединения В. Полученные результаты показаны в табл. 1. Более 300 Более 300 ЬОО-1000 Пример. В 500 мл колбу За kyguchi загружают 100 мл культуральной среды и штамм Stachybotrys sp. Т-791 культивируют при 25°С, рН 5,5 в течение 4 дней при встряхивании. Культуральная среда содержит, % Глицерол0,5 . Крахмал1,0 Сахароза0,2 Порошок сои0,5 Пентон 0,1 Экстракт солода0, 2 Сульфат магни.я0,3 Соляная кислота0,05 30-литровый ферментационный сосуд загружают 20 л культуральной среда указанного состава и полученнуй- в колбе культуру выращивают в культуральной среде при в течение 5 дней при перемешивании со скоростью 300 оборотов, .в минуту и скорости аэрации 1 литр на литр культуральной среды в минуту. Полученный .куль- 10 туральный бульон центрифугируют сО скоростью 8000 обсчотов в минуту для удаления микробных клеток, а рН поверхностного слоя устанавливают 1 кс нценТ рированной соляной кис- 15 лот.ой. Полученные про ципитаты собирают центрифугированием и экстрагиР5ПОТ. метанолом. Как видно из табл. 1, значение сотрой токсичности (ЛДдо) соедияв- 20 ния позволяет применить его в качестве лечебного препарата. Фракцию метанола адсорбируют на колонке с активированным углем (500 мл) после ее упаривания при по- с миженном давлении. Колонку элюируют всщньш 30%-ным раствором ацетона, а затем водным 50%-ным раствором ацетона. Фракцию 50%-ного водного раство- ра ацетона собирают и упаривают до- суха в вакууме. Остаток адсорбируют 0 на колонке силикагеля и проявляют смесью хлороформа и ацетона (в объемном отношении 2 : 1 и 1:1) в качестве ;п(рдвижной фазы. С другой стороны фракцию, содержащую 3-0 ф-о-глуку- 35 ронпиранозил)-соясапогенол В, соот-г вехствующую фракции, имеющей значение ,38, полученной тонкослойной хроматографией на силикагеле . Kiesel Yel 254 с использованием 40 смеси хлороформа метанола и воды (в объемном отнодении 65:35:8) в качестве элюирующего раствора, собирают и концентрируют досуха при пониженном давлении. Концентрат сно- 45 ва адсорбируют на колонке силикагеля и элюируют смесью хлороформа с .ацетоном лоочередно {в объемных отношениях 2i2 и 111) и фракцию, сорт- : ветствукицую описанной, отбирают и концентрируют досуха. Кристаллизацией остатка из смеси хлороформа с ацетоном (в объемном отношении 1:1) получают 46 мг 3-0 (р-О-глукуронпиранозил)-соясепогенола В. Т.пл. 231-232 (с разложением). 55 П р и м е р 2. Берут следующие количества, мг: . ко во на дл ют ко до ва су ;м ла Пр зи ко I ав см зат обы для таб ТСровтаб луч соя не Натриевая соль соединения 500 Глюкоза250 Дистиллированная вода для инъекции до общего объема5 мл Натриевую соль соединения и глюу растворяют в дистилированной е для инъекций в 5 мл ампуле. Воздух заменяют азотом, ампулу ревают при 12lc в течение 15 мин стерилизации раствсфа и получапригодный для инъекций препарат. П РИМ ер 3. Берут следукщие ичества, мг: Соединение сох ласно изобретению75 0 Полусинтетиче.ское глнцерйдное основание для ойцего веса2000 Соединение, согласно .изобретению авляют к прлусинтетическрму осноию глицерида, смешивают их и пендируют при . Продукт ааают в форму и Рставляют для РХдения -в естественных условиях. дукт вынимают и дРлучают суппоорий, П р и м е р 4. Берут следующие ичества, г: Соединение согласно изобретению150 Авицел (коммерческре название пррдукта, выпускаемого Asahl Kasei Kubashiki Kaisha)40 Крахмал зерновых культур30 Стеарат магния . 2 ТС-5 (коммерчеркое название оксипррпилметилцеллюлозы)10 Полиэтиленгликоль 3 Касторовое масло 40 Метанол40 Соединение согласно изобретению, цел, крахмал и стеарат магния шивают и растворяют в порошок, ем табЛеттируют с использованием чного сахарного порошка (пудры) получения покрытия. Полученные летки покрывают составсж из 5, полиэтиленгликоля 6000, кастоого масла и метанола и получают летки с пленочным покрытием. Предложенный способ позвРляет поить 3-0 Ср-О-глукуронпиранозил)сапогенрл, используемый в медицив качестве лечебного препарата.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3-0 {B -DгаУКУРОНПИРАНОЗИЛ)-с6яСАПОГЕВОЛА В формулы -OR СООН о т л и ч а ю ц и и с я тем, что микроорганизм Stachybotrys sp. щтсшм Т-791 выращивают в -аэробных условиях в пятательной сре«е, содержащей источники азота и углерода, минеральные соли в следы микроэлементов/ ПРИ РН 3,5-11,5 и температуре 15г-38 С с после(Д юпе1м выделеиием целевого продукта из культуральной и при необходимости переводят в соль.