Способ получения сесквитерпенового производного Советский патент 1982 года по МПК C07D307/94 A61K31/343 A61P1/00 A61P27/14 A61P29/00 A61P35/00 A61P37/00 C12P17/04 

(5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕСКВИТЕРПЕНОВОГО Изобретение относится к способу получения сесквитерпенового производного формулы т CHjLi HjC СНз или его фармацевтически приемлемой обладающего фармакологической акти ностью. Известен способ получения сескв терпенового углеводорода - гвайазу лена формулы Н1СН5)2 ПРОИЗВОДНОГО заключающийся в том, что гвайол формулы9Q С(СНз)2 . СН,); ОН дегидратируют с помощью муравьиной кислоты и затем дегидрируют серой при 1 . Однако в литературе не описан, способ получения сесквитерпенового производного формулы I, которые могут найти применение в медицине в качестве фармацевтического препарата. Цель изобретения - способ получения нового фармакологически активного сесквитерпенового производного формулы I. Поставленная цель достигается споробом получения сесквитерпенового производного формулы 1, заключающимся в том, что проводят эробное культивирование микроорганизма вида Stachybotrys в питательной среде, содержащей один или более усвояемых источников азота, такие как

от замачивания кукурузы, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, овсяная мука, мясной экстракт, гидролизованный казеин, соли аммония, нитраты, глицерин или углеводы, такие как глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, меласса или крахмал, неорганикарбонаты, хлористый натрий, сульфат магния или фосфорная кислота, и микроэлементы, такие как железо, медь, магний, цинк при рН ,5 и температуре с последующим выделением целевого продукта из культурального бульона.

Из микроорганизмов предпочтительно используют Stachybotrys altermans i FO 9355 Stachybotrys chariairum FO 5369 Stachybotrys chartarum IFO 7222, Stachybotrys cylindrospora 8853, Stachybotrys echinata 7525, Stachybotrys renifornus 70б7( Stachybotrys sp, Stachybotrys sp, 1-789 или Stachybotrys sp. T-791.

Сесквитерпеноаое производное формулы I обладает антикомплементарной активностью иможет найти применение в качестве активного ингредиента в лекарствах, эффективных против аутоимунных заболеваний, нефрита, ревматизма, коллагеновых заболеваний, аллергических заболеваний и рака.

Микроорганизмы вначале культивируют в среде, содержащей обычные источники питания и добавки. Источниками азота, обычно используемыми в культивируемом субстрате, являются, например, порошок соевых бобов, жидкость от замачивасоевое масло, дрожжевой экстрактр ния кукурузы,

овсяная, мука, мяссухие дрожжи, ной экстракт.

гидролизованныи казеи нитратные соли. Примерами подходящих источников углерода являются глюкоза, глицерин, мальтоза, крахмал, лактоза, сахароза и меласса Примерами добавок в питательную среду являются такие неорганические соли, как карбонат кальция, хлористый натрий, сульфат магния, и фосфорная кислота. Питательная среда содержит незначительные количества солей таких металлов, как железо, медь, марганец и цинк. Культивация может осуществляться в обычной водной среде, содержащей указанный выше субстрат с использованием техники по верхностной культивации или техники погружной культивации с аэрированием и перемешиванием. Предпочтительно является погружная культивация с аэрированием и перемешиванием. Культивацию проводят при 2032°С в течение дней, обычно при аэрировании, поддерживая рН питательной среды ,5-9,5.

.После культивации долученное вещество выделяют из культурального бульона. Способ выделения особо не ограничивается и могут быть использованы различные известные способы, применяемые в зависимости от физико-химических свойств полученных веществ. Выделение может быть осуществлено, например, с метода, использующего различие -в растворнмости между продуктами и примесями, метода 5 использующего ( различия в адсорбционной способности и средстве к обычным адсорбентам, таким как активированный уголь ХАД-2р силикагель, ионообменные смолы, или Сефадекс, метода, использующего различия в коэффициенте распределения между двумя жидкими фазами, и комбинации таких методов

Обычно культуральный бульон фильтруют иликонцентрируют обычным образом для удаления клеточной массы. Затем добавляют метанол к всплывшему слою жидкости, смесь перемешивают и оставляют стоять 2-3 ч. Осадок отделяют.с помощью дополнительного центрифугирования. Остаток экстрагируют равным объемом этилацетата и отгоняют растворитель. Экстракт помещают в метанол и метанольный раствор пропускают через колонку с активированным углем из элюата отгоняют растворитель Остаток подвергают гель-фильтрации на Сефадексе ЬН-ЗО. Каждую из получанных фракций подвергают тесту на антикомплементарную активность о Собирают активные фракции и отгоняют растворитель, получают чистый 6,7 диокси-2,5,5,8а-тез;раметия-1,2,,5,6,7,8,Яа-декагидронафталин -1-спиро- $,-(6 ,7-диформил-4-окси-2,3-дигидробензофуран). Пример 1. В колбу Сакагуши 500 мл загружают 100 мл питатель ной среды следующего состава и куль тивируют Stachybotrys sp. К-уб при 28 С и рН 6j при встряхивании. Состав питательной среды, %: Глицерин 0,5 Крахмал1,0 Лактоза0,2 Порошок соевых бобов0,5 Экстракт дрожжей 0,1 Мясной экстракт 0,2 CaCOj0,3 ,05 В ферментатор, емкостью 30 л, загружают 20 л питательной среды пр веденного выше состава и одну колбу полученной посевной культуры культивируют в питательной среде при 28°С в течение 5 дней при перемешивании со скоростью 300 об/мин и циркуляцией воздуха со скоростью 1 л/л питательной среды в минуту. Полученный культуральный бульон цен рифугируют со скоростью ВООО об/мин для удаления микробных клеток, К ве нему всплывшему слою жидкости прибавляют 5 л метанола, смесь перемешивают, а затем оставляют на 3 ч. Смесь центрифугируют для удаления осадка и отделяют верхний всплывший слой, остаток экстрагируют равным п объему количеством этилацетата. Отгоняют растворитель из этилацетатно го слоя при пониженном давлении. Ос таток растворяют в метаноле и пропу кают через колонку с активированным углем. Концентрируют элюат досуха при пониженном давлении. Сухую массу раствсряют в смеси хлороформа с зтилацетатом (1:1) и подвергают ге фильтрации через колонку с Сефадексом L.H-20. фильтрат подвергают тон кослойной хроматографии, используя смесь этилацетата, хлороформа и уксусной кислоты (объемное соотношени 50:50: 4) в качестве растворителя, и собирают фракцию, обладающую антикомплементарной активностью, соот ветствующую R 0, Альтернативно фильтрат подвергают тонкослойной хр матографии, используя смесь бензола, бутанола и уксусной кислоты (объемное соотношение 60:15:5) и со бирают фракцию, обладающую антикомп лементарной активностью, соответ06ствующую-Rjf 0,58. Выпариванием растворителя из фракции получают 2,0 г 6J7-диoкcи-2,5,5,8а-тетраметил-1,2, 3 ,4,4а,5 ,6,7|8,8a-дeкaгидpoнaфтaлин-1 -спир6-2- -(6,7-диформил-4 -окси-2,3-дигидробензофурана). otj J° -48 (,5; метанол) УФ-спектр (этанол) :Л1т,с(х 216 (е 1б+74) и 307 нм (е 6659). Пример2, В колбу Сакагуши, емкостью 500 мл, загружают 100 мл питательной среды, имеющей следующий состав, и культивируют на ней известный штамм Stachybotrys chartarum 3FO 53б9, при в течение дней при рН 6, с обратным встряхиванием. среды, %: Состав питательной Глицерин 0,5 Крахмал 1,0 . 0,2 Ла ктоза Порошок соевых Экстракт дрожжей Мясной экстракт В ферментатор, емкостью 30 л, загружают 20 л питательной среды и засевают двумя колбами полученной культуры, культивируют при 28°С в течение 5 дней при перемешивании со скоростью 300 об/мин при скорости циркуляции воздуха 1 л/л среды в минуту. Полученный культуральный. бульон центрифугируют со скоростью 8000 об/мин для удаления микробных клеток. К всплывшему верхнему слою прибавляют 5 л метанола, смесь перемешивают и оставляют на 3 ч. Смесь центрифугируют для удаления осадка, всплывший верхний слой удаляют, остаток экстрагируют равным количеством по объему этилацетата. Удаляют растворитель из этилацетатного слоя, концентрируя досуха при пониженном давлении о Остаток растворяют в метаноле и пропускают через колонку с активированным углем Элюат концентрируют досуха, при пониженном давлении, растворяют в смеси хлороформа и этилацетата (1:1) и подвергают гель-хроматографии на колонке с Сефадексом ЦН-20, Собирают фракции,, имеющие величины R, приведенные в примере 1, При выпаривании растворителя получают 2,2 г 6,7-диокси-2,5,5,8а-тетраметия-1,2,3,,а,5,6,7,8,8а декагидронафталин-1-спиро-2 -{6, 77Диформил- -окси-2 ,3 -Дигидробензофурана)„

П и м е р 3. Stachybotrys sp. 1-789 культивируют и очищают аналогично примеру 1, с тем исключением, что используют другую питательную среду, регулируя рН на уровне 7,5 при температуре культивации 32 С

Состав питательной среды,:

Глицерин0,5

Глюкоза1,2

Жидкость от

замачивания

кукурузы0,5

Сухие дрожжи0,1

Солодовый- экстракт0,2

MgSO.0,05

NaCl0,3

Получают 6,7-ДИОКСИ-2,,8а-тетраметил-1,2,,,,8а - декагидронафталин-1-спиро-2 -(6 , -диформил-l -окси-2 ,3--дигидробензфуран).

Пример. Культивируют Stachybotrys sp, Т-791 и очищают по прмеру 1, с тем исключением, что питательная среда имеет следуклций состав и рН 5,5 S температуру культивации поддерживают равной .

Состав питательной среды, %:

Глицерин0,5

Крахмал1 ,-0

Сахароза0,2

Порошок соевых

бобов0,5

Пептон0,1

Солодовой экст

ракт0,2

MgS04ОрЗ

НС10,05

Получают 6,7-ДИОКСИ-2,5,5,8а-тетраметил-1,2-;3,,,5,6,7,8,8а-/ екагидронафталин-1-спиро-2-(6,7 -ДИформил- -окси-2,3-дигидробензофуран) . I.

Примерз Микроорганизм Stachybbtrys sp. К-7б подвергают культвированию и очистке аналогично примеру 1, за исключением того, что в данном случае процесс проводят в питательной среде нижеследующего состава и продолжительность культивирования равна 5 дням.

Состав питательной среды:

Овсяная мука, г30

Крахмал, г10

Первичный кислый

1 фосфат калия, г Минеральные микродобавки, мл

1 Вода, мл1000

Получают 2,1 г 6,7-Диокси-2,5, 5,8а-тетраметил-1,2,3,,а,5,6,7, 8,8а-декагидронафталин-1-спиро-2 -(6 ,7-Диформил- -окси-2 ,3-дигидробензофурана),

П р и е р 6, Микроорганизм Stachybotrys зр, К-7б подвергают культивированию и очистке по примеру 1, 5 за исключением того, что в данном случае процесс проводят в питательной среде нижеследующего состава и продолжительность культивирования равна 5 дням.

0Состав питательной среды

Нитрат натр.;, г3

Вторичный кислый фосфат калия, г1

Гептагидрат сульфата 5магния, г0,5

Хлорид калия, г0,5

Минеральные микродобавки, мл1 Крахмал, г 31} Вода, мл 000:

Получают 2,0 Г 6,7-Диокси-2,5,5р 8а-тетраметил-1 ,2,3 ,4,48,6,7,8,8а-декагидронафталин-1-спиро-2 -(6, 7-диформил- -оКси-2 ,3 -дигидробензофурана)«

П р и м е р 7. Микроорганизм Stachybotrys sp. К-7б подвергают культивированию и очистке аналогично примеру 1 , но в данном случае процесс проводят в питательной среде нижеследующего состава и продолжительность культивирования равна 5 дням. Состав питательной среды Гидролизованный казеия, г5

Крахмал, г20

Первичный кислый фосфат калия, г1

Минеральные микродобавки, мл1 Гептагидрат сульфата магния, г . 0,5 Вода, мл 1,000 Получают 2,2 г 6,7-Диокси-2,5,5, 5 8а-тетраметил-1 ,2 ,3,,4а,,7,8, 8а-декагидронафталин-1-спиро-2-(6-7 -диформил- -окси-2 ,3-дигидробензофурана).

Пример 8, Микроорганизм Stachybotrys s.p, К-7б подвергают культивированию и очистке аналогично примеру 1, но процесс проводят в питательной среде нижеследующего состава и продолжительность культивирования равна 5 дням,

Состав питательной среды Сульфат аммония, г1

Крахмал, г20

Гептагидрат сульфата магния, г0,5 Первичный кислый фосфат калия, г1 Минеральные микродобавки, мл1 Вода, мл1,000 Получают 1,9 г 6,7-Диокси-2,5,5, 8а-тетраметил-1,2,3 ,,,5,6,7,8, 8а-декагидронафталиН-1-спиро-2 -(6, у-диформил-Ь-окси-2,3-дигидробензофурана).

8 примерах 5-8 используют добавки микроэлементов следующего состаа;

Гептагидрат сульфата двухвалентного желе0,1 за, г

Тетрагидрат хлорида двухвалентного марП,1 ганца, г

Гептагидрат сульфа0,1 та цинка, г Пентагидрат сульфа0,01 та меди, г 100 Вода, мл

Раствор добавляют в качестве 1 мл на каждые 1000 мл пи тательной среды.

Формула изобретения

1. Способ получения сесквитерпенового производного формулы

соли, такие как соли кальция, карбонаты, хлористый натрий,сульфат магния или фосфорная кислота,и микроэлементы такие же как железо,медь,магний,цинк, при рН 3,5-11,5 и температуре 15-35°С с последующим выделением целевого продукта из культурального бульона.

2о Способ по п. 1, отличающийся тем, что микроорганизм выбирают из группы, состоящей из Stachybotrys altermans 3FO 9355 Stachybotrys chariarim 3FO 5369 Stachybotrys chactarum 3FO 7222, Stachybotrys cyVlndhospora 8853, Stachybotrys echinata 7525, Stachybotrys renifornus 7067, Stachybotrys sp. K-76, Stachybotrys sp. 1-789, и Stachybotrys sp. T-791.

Истопники информации, принятые во внимание при экспёрт 1зе 1, Физер Л., физер М. Органическая химия.М.,Химия,1970,т,2,с.502.