Способ получения @ -галактозидазы Советский патент 1982 года по МПК C12N9/38 

(5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Р) -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам получения фермента р)-галактозидазы.

.-- 5

Известен способ получения .(i-raлактозидазы путем культивирования штамма,- продуцента Aspergillus огу2ае FERM-F-1680 на питательной среде, содержащей отруби в качестве источ- Q ника азота и другие питательные компоненты с последующим выделением и очисткой фермента. Полученный препарат гидролизует лактозу, O-un-нитрофенил-р-О-галактопиранозид и фенил- ts -p-D-галактопиранозид fl.

Активность фермента невысока.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения р-галактозидазы, предусматривающий культиви- го рование продуцирующего его микроорганизма штамма рода Реп ici Ill urn на питательной среде, содержащей ассимилируемый углерод и источники азота совместно или без минеральных солей

в аэробных условиях при и рН среды 3, в течение 16-120 ч с последующим выделением фермента из культуральной жидкости экстракцией растворителем, осаждением, очисткой, фильтрацией и т.д. 2.

Полученный фермент обладает достаточно высокой активностью, но не яв.ляется термически стабильным и должен храниться на холоду.

Цель изобретения - повышение стойкости и активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения |3-галактозидазы, предусматривающему культивирование продуцирующего его микроорганизма штамма из рода PeniciIlium на питательной среде, содержащей ассимилируемый углерод и источники азота совместно или без минеральных солей, в аэробных условиях с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, в качестве продуцирую3щего микроорганизма используют штамм PeniciMium multicolor KU-0-312, идентифицированный как FtRM-5 375 или АТСС 20539, а в качестве источника азота - отруби. Сущность способа состоит в том, что для получения фермента р-галакто зидазы используют штамм PeniciHium multicolor KU-0-312. Этот штамм депонирован в японском депозаторном институте по иссле дованию ферментации Агентства индус риальной науки и технологии Японии Киаго Тиба .Слти 25 января под номером FERM-P 375 а также в. Американско Коллекции типовых культур под номером АТСС 20539. Морфологические.свойства, присущи штамму Peniciliium multicolor KU-0-312. Макроскопические наблюдения (после инкубации при в течение 10 дней на агаровой среде Чапека). При росте Peniciliium multicolor образуются колонии диаметром 30 «О мм. Поверхность радиально морщинистая с плотным бархатистым слоем конидиумов от глубоко сине-зеленого до серовато-зеленого цвета, периферия на ширину 1-2 мм от оранжевого до желтого цвета. Обратная сЛрона от желтого до коричневого цвета. Микроскопические наблюдения (после инкубации при в течение 10 дней на агаровой среде Чапека). Пучки мономутовочные. Конидофоры прямые и вертикальные без разветвления, шириной 2-3 мк с расширением к концу. Стеригма: от 6 до It стеригм в пачке. Конидиум сферический или овальной формы диаметром 2-3 мк.. Поверхность гладкая. При использовании предлагаемого способа штамм Peniciliium multico-lo может культивироваться в жидкой или в твердой питательной среде при применении известных методов в анаэробных условиях. Культуральная среда содержит одно или более природное питательное вещество, а именно пшеничные отруби,.рисовые отруби, обезжиренную соевую муку, муку хлопковых семпн, в качестве основных компонентов. Купьтуральная среда может также содержать лактозу, крахмал,глюкозу, апаПинозу и ксилозу в качестве источ ника угперода и сульфат аммонир, нит 1Ц рат натрия, пептон, солодовый и дрожжевой экстракт в качестве источника азота. В куль туральную среду могут быть включены неорганические соли, например фосфаты и соли магния и кальция. Обычно целесообразно проводить культивацию Peniciliium multicolor при 10-35 С, предпочтительнее 25-33 С, в среде с рН -9, предпочтительнее 5-7, в течение 1-8 дней, хотя условия культивации могут изменяться в зависимости от способа культивации. Продуцирование новой/3-галактозидазы согласно предлагаемому способу достигает максимума после 2-6 дней инкубации. При культивировании втвердой среде новая р-галактозидаза может получаться с активностью около 1000 едидиниц на 1 г твердой культуральной среды. При культивировании в жидкой среде можно получить фермент с активностью около 150 единиц на 1 мл жидкой среды. Для извлечения р-галактозидазы согласно изобретению из культуральной среды Peniciliium multicolor, где образуется и накапливается фермент, жидкую культуральную среду освобождают от твердых веществ фильтрацией или центрифугированием и полученный фильтрат затем концентрируют отгонкой под уменьшенным давлением или пропускают через диалитическую мембрану и затем подвергают процессу высаливания сульфатом аммония или процессу осаждения ацетоном и/или этанолом для получения неочищенного порошка / -галактозидазы. Твердую культуральную среду обрабатывают водой (для экстракции фермента) и полученный водный экстракт обрабатывают таким же образом как упомянутый фильтрат., Сама культуральная среда, фильтрат и водный экстракт могут использоваться в качестве неочищенной |Ь-галактозидазы. Для дальнейшей очистки неочищенная -галактозидаза может быть обработана по известному методу очистки энзимов, например методом ионообмена, гелевой фильтрации, диализа, адсорбции и методом осаждения протеина. Когда концентрированный фильтрат или водный экстракт, содержащий р-галактозидазу, смешивают с ацетоном до содержания его вес., почти вся |5-галактозидаза может быть осаждена в виде порошка, который после сушки обнару59

живает, например, высокую галактозидазную активность порядка З,8ед./м Порошковая р-гаг актозидаза активностью 3,8 ед/мг обычно не требует дальнейшей очистки, если назначается орально не переносящим лактозы пациентам в виде порошка, гранул или таблеток в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, например крахмалом, может быть растворена в молоке и любом напмтке, принимаемом пациентом.

Активность р-галактозидазы оценивают по обычному методу испытания следующим образом.

Смешивают 1 мл субстратного раствора, содержащего мг/мл о-нитрофенил-| -0-галактопиранозида в воде, 2 мл 0,2 М забуференного раствора макильвана (рН 1,5) И(1 мл раствора энзима, смесь нагревают при З7с 15 мин для вызывания энзиматической реакции. После этого реакционную

смесь смешивают с 1 мл водного 1 М раствора карбоната натрия для останоки реакции. Для определения содержания образовавшегося о-нитрофенила реакционную смесь подвергают колориметрическому анализу при длине волны 420 мкм, используя эталонную кривую для колориметрического анализа о-нитрофенола. Когда энзим может давать 1 мкмоль о-нитрофенола в 1 мин считается, что этот энзим имеет 1 единицу активности.

Для подтверждения преимуществ энзиматических свойств р-галактозидазы, полученной согласно предлагаемому способу, их сравнивают со свойствами известной р-галактозидазы из РепiciIlium citrinum, которая является представительной для галактозидазы продуцируемых другими видами РепiciIlium 2 . Результаты этого сравнения представлены в таблице..

Субстрат (гликозиды) Лактоза

о-Нитрифенил-| -0-галактониранозид п-Нитрофенил- -0-галактониранозид

Молекулярный вес

(по гелевому методу)

Оптимум рН

Активное рН (пределы, в которых активен энзим)

Оптимум температуры, С

Активная температура (пределы температуры, в которых активен энзим),

Стабильность при рН (предел рН, в котором энзим стабилен при стоянии в тчение 2 ч при А с)

Термическая стабильность (остаточная (ггалактозидазная активность после стояния 15 мин при рН 6), %, при температуре, С

60

Относительная

100

22i(

186

Около

120000

4,5

3,5-8 50

Менее 60

3,5-8,0

2,5-8,0

100

65

70

75

Эффект металлических ионов лярной концентрации 10

Железо () Медь () Ртуть (Нд)

Пример 1. Твердую культуральную среду, состоящую из 10 г пшеничных отрубей, 10 г обезжиренной соевой муки и 20 мл воды, загружают в 500 мл коническую колбу и стерилизуют при 15 мин в автоклаве и затем заражают косой культурой Penici11ium multicolor KU-0-132. Зараженную среду затем инкубируют в стерильном воздухе при 28 С, k дня и затем смешивают с 200 мл водного экстракта й-галактозидазы в водной фазе. Смесь отфильтровывают для удаления твердых веществ. Полученный фильтрат, т.е. водный экстракт, обнаруживает р-галактозидазную активность в 228 ед./мл.

Пример 2. Жидкую культуральную среду (100 мл), содержащую 3 рисовых отрубей, 1 муки хлопковых семян, 0,25t, кислого фосфата калия и 0,15% фосфата калия (рН 6,2) загружают в 500 мл колбу и стерилизуют нагреваниеи в автоклаве, СтерилизоПочти не ингибитируется

Почти не ингибитируется

Почти не ИНГИбитируется

ванную среду заражают косой культурой PeniciПium multicolor KU-0-132 и культивируют с взбалтыванием при 28 С 3 дня на взбалтывающем столе. Инкубированную среду отфильтровывают. Полученный фильтрат обнаруживает j -галактозидазную активность в 140 .

Пример 3aJ Твердую культуральную среду, состоящую из равномерной смеси 1,5 кг обезжиренной соевой муки, 1,5 кг муки хлопковых семян и 3 л воды, помещают в виде слоя в больиюй бак и стерилизуют нагреванием в автоклаве.

Стерилизованную среду заражают 150 г посевной культуры Penici11ium multicolor KU-0-132, полученной инкубированием косой культуры этого микроорганизма в среде из отрубей (смесь пшеничных отрубей и воды в соотношении 1:1 по весу). Затем зараженную среду спокойно инкубируют при 5 дней и инкубированную ере