Способ определения гуморального иммунитета Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

о

4

сл

00

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно.к иммунологическим способам диагностики, в частности к способам определения гуморального иммунитета, ив особенности может применяться для оценки такого иммунитета при наблюдении за .состоянием, развитием и течением заболевания человека и животных с чертами аутоиммунного процесса, например ревматических заболеваний хронических заболеваний легких, хроничес1 их реакций отторже НИИ трансплантата.

Известны рпособы определения гуморального иммунитета, состоящие в раздельном определении активности комплемента и антител по реакции потребления комплемента pTj и 2j.

Недостатком способов является приблизительное и неточное определение содержания антител, так как оно базируется на визуальном учете частичного гемолиза эритроцитов баг рана или 100%-го гемолиза эритроцитрв в гемолитической системе, реа,г гирующей с комплементом, несвязан -, ным .антиген-антителом. Кроме того, способы не. предполагают одновременное определение уровня антител и активности комплемента. Недостатком способов является также то, что содержание антител выражают в процентах разности степени гемолиза, которую оценивают визуально в контрольных и опытных пробах, или усовных обозначениях типа + и +Н-. Указанные недостатки не позволяют одновременноуОбъективно суить о степени взаимЬсвязанных компонентов единой иммунологической еакции, а именно антител, антигена и комплеме.нта, на их определение застрачивается много времени.

Известен также способ иммунохимического определения антигенов с по- . ощью фотометрии з .

Однако известней способ позволяет определить только один участник гуморальной реакции, а именно антиген в условных единицах экстинции.

Целью изобретения является повышение точности и ускорения спосо6а.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа путем выявления антигенов в сыворотке крови с помош,ю фотометрии одновременно дополнительно ВЫЯВ:ЛЯЮТ в

сыворотке крови содержание ануител и комплемента в единицгис активности комплемента по СИ 50%.

Способ осуществляется следующим образом..

В три пробирки наливают по 0,1 м исследуемой сыворотки. Первую из ни

используют для определения комплемента, вторую и третью - для определения антител и антигена. Во вторую .пробирку прибавляют 0,1 мл тканевого

антигена, доведенного по белку до 5 концентрации не менее 1 г/л, .в

третью - 0,1 мл антисыворотки к йс-. следуемому е нтигену с титром антител в РСК в пределах 1:400-1V600. Антиген и антисыворотка должны быть

0 проверены на комплементарность, антикомплементарность и- гёмотоксические свойства. В каждую из про. бирок доливают до 1,0 мл ве.ронал-мединаловый буфер (рН 7,3) и помещают

5 в термостат при .на 45 мин. Через каждые 15 мин пробы встряхивают. Содержимое каждой пробирки делят на четыре порции по О,1, О,2, О,3 и 0,4 мл, после чего каждую из порций

Q доводят веронал-мединаловым буфером до объема 0,5 мл; и таким образом получают разведения исследуемой сыво ротки в соотношениях 1:100, 1:5.0, :.: 1:37,5 и 1:25 (разведения подобраны

5 такимобразом, что именно в этих разведениях происходит не более, чем 50%-й гемолиз сенсибилизированных эритроцитов барана). Затем в каждую из полученных проб прибавляют по

0,5 мл стандартизированной фотомет рическил способом 4%-й взвеси бараньих эритроцитов с козффициентом ЭКС / . тинции 0,86+0,01. Полученную гемолити- ческую смесь перемешивают и инкубируют 30 мин при 37°С, зачтем охлажда5 ют до 18-20°С (комнатной температуры) центрифугируют при 1500 об./мин в течение 10 мин. В аналогичных условиях проводят контрольные пробы с 0,5 мл веронал-мединалового буфера и 0,5 мл

0 сенсибилизированных эритроцитов барана для исключения спонтанного гемолиза. Для колориметрирования берут пробы с частичным гемолизом и сблори- .. метрируют при синем светофильтре в

5 кювете 3,0. Серию проб для определения комплемента колориметрируют первой и определяют общую комплементарную активность сыворотки крови в единицах активности комплемента по

Q СИ 50%, соотнося показатели ФЭК со степенью гемолиза эритроцитов барана по стандартной шкале гемолиза. Затем пр величине экстинцИи, соответствующей определенному проценту гемое лиза, получают активность комплемента в стандартных единицах в 1 мл сыворотки крови. Затем колориметрируют пробы, обработанные антигеном и антисывороткой, и по результатам колориметрии пересчитывают содержание аитигена и антиген в 1 мл сыворотки.Пример. При колориметрии проб сыворотки из разведения первой пробирки (определение комплемента) 5 получены показатели ФЭК:О,17 - в разведении 1:100; 0,29 - в разведении 1:50; 0,34 - в разведении 1:37,5 0,39 - в разведении 1:25, что соот ветствует 30, 60, 70 и 90% гемолиза Таким образом, в расчет принимаются результаты колориметрии разведения, где гемолиз не превышает 50%, т,а. в примере это разведение 1:100. Из таблицы соотнесений степени гемолиза и активности комплемента по СН. 50% находят, что активность ко№племента: в разведений с авороткй 1: 100 равна 0,84 ЕД по GH 50%, т.е. активность комплемента нативной сыворотки 0,84x100 84 ЕД. При колориметрии сыворотки, обработанной антигеном (определение антител), получены показания ФЭК:0,12 в разведении 1:100, 0,23 - В разведении 1:50; 0,30 - в разведении 1: 1:37,5; 0,55 - в разведении 1:25, что соответствует 20, 45, 60 и 70% гемолиза. В расчет принимаются разведения 1:100 и 1:50, что соответствует активности комплемента О,76 и 0,48 ЕД или на 1 мл нативной сыворотки 76 и 48 ЕД, или усредненно 76+48 124, 124:2-62 ЕД. Вычтя величину затраты комплемента после;обработки сыворотки антигеном (т.е, связывания комплемента комплексом ан тиген-анти тело) из общего содержа1дая комплемента, получают содержания комплемента, соответствующую концентрации (содержанию) антител . При этом содержание антител выражают в той же разности - активнос. ти комплемевта по СН 50%. В примере это 84-62 22 ЕД. При колориметрии сыворотки, обработанной антисывороткой против антигена (определение антигена), получегал показания ФЭК: 0,15 - в разведении 1:100, 0,27 - в разведении 1:50 6,32 - в разведении 1:50, 0,32 - в .разведении 1:37,5 и 0,36 - в разведении 1:25, что соответствует 25, 55, 70 и 80%--гемолиза, В расч/ет принимают раз ведение 1:100, чтр сОответствует 0,8 ЕД или на 1 мл на тивной сыворотки 80 ЕД. Разница между активностью общего комплемента и его затратой после реакции с анти сывороткой отражает содержание циркулирующего антигена 9 той же размерности - активности комплемента по СН 50%. В примере это 84-80 4 ЕД Таким образом, исследована сыворотка, содержащая 84 ЕД комплемента, 22 ЕД антител и 4 ЕД антигена. По предлагаемому способу выполнено обследование 132-больных ишимической болезнью сердца. Исследован миокардиальный антиген и антитела к нему, а также антитела к.анти- . гену атеросклеротическй измененной, интшой аорты и ткани щитовидной железы . Установлена высокая точность способа по оценке аутоиммунного про - цесса как в стадии появления антигена, так и в стадии образования антител, что позволяет вести строго дифференцированную по времени И/ интенсивности иммуномодулирующую терапию или обоснованно воздерживаться от нее.. Содержание аутоантитёл к миокардиальному антигену в одинаковых се риях сывороток приведено в табл. 1. Как видно иа табл. 1, для серий сывороток 5, и 12 определение аутоантитёл по изй. способу невозможно несмотря На их наличие. Сравнительные данные предлагаемого -известных спосюбов приведены в табл. 2. ; Таким образом, 9 соб позволяет более точно (на 40%) и в более короткий срок в единой системе учета (единицах активности комплемента одновременно определять все факторы гуморального яммунитета: комплементы, антиген и антитела. .Таблица 1

Таблица 2

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГУМОрАльного ИММУНИТЕТА путем выявле ния антигенов в сыворотке крови с помощью фотометрии, от л и ч а ю щи и с я тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, одновременно дополнительно выявляют в сыворотке крови содержа ние антител и комплемента в единицгис активности комплемента по СН 5.0%,

ПредлагаАГ, 0,05-0,1 45 мин емый

Известный ш

0,05-0,1 45 мин

AT Известный И 0,05-0,1 90 мин

AT или АГ . 0,1

РСК

Известный

3-20

АГ При меча и и

0,2

18-24 ч +, 4-+ 0,2 в титре

0,25-0,5

60 мин

БД экстинциие: АГ - антиген, AT - антитела, С - комплемент; Количество определяемого вещества в мкг/мл азота антител. По СН 50% 0,1 +, 4-+ 1,0