Способ регенерации растенийлюцЕРНы Советский патент 1981 года по МПК A01H3/00 

(54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ ЛЮЦЕРНЫ

IN viTRO

1

Изобретение относится к сельскоему хозяйству и может быть использовано в селекции и семеноводстве, в . частности для соматической гибридизации, клеточной селекции, ускоренного размножения растений в исследованиях по фитопатологии, физиологии игенетике растений.

Известен способ ферментативного выделения изолированных протопластов растений из клеток суспензионных культур, в частности сои, арахиса, фасоли 1.

Однако получить растения-регенеранты из таких протопластов до сих пор не удавалось.

Наиболее близким к изобретению является способ регенерации растений люцерны из протопластов, выделенных с помощью ферментов из каллусов листового происхождения 12.

Однако этот способ применим только для растений, у которых -листовые эксплантаты образуют крупные, рыхлые Ксшлусы, пригодные дЛя мацерации в растворе ферментов. Частота таких растений среди различных сортов и гибридов люцерны колеблется в пределах 10-30%. Таким образом, этот способ имеет лишь ограниченное применение. Минимальный срок, необходимый, для получения регенерантов этим спо-ч собом, довольно продолжителен и составляет 5 мес.,а выход регенерантов в расчете на 1 каллус незначителен (в среднем получают 3 растения на 1 каллус).

Целью изобретения является ускорение процесса регенерации растений и повышение его эффективности.

Поставленная цель достигается тем, что листочки, то есть пластинки тройчатого листа, культивируемых сортов и гибридов люцерны стерилизуют в

15 0,1%-ном водном растворе диоцида и после трехкратной промывки в стерильной дистиллированной воде делают на каждом из них ряд надрезов по всей площади пластинки и помещают на основную питательную среду Гамборга в5 13,которую дополнительно вводят бООр-8000 мг/л бактоагара и 200.300 мг/л нитрата аммония, содержание железа сернокислого (FeSO4- 7Н2Р) увеличивают до 70-100 мг/л, трилона Б (Na2.3DTA) до 25000-35000 мг/л и вносят следу рщие фитогормоны: 2,4-дихлор феноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 816 мг/л кинетин - 6-10 мг/л и -30 -нафтилуксусную кислоту (НУК) - ,5 мг/л, а рН среды доводят до 5,86,0.

Материал инкубируют 10-16 дней при непрерывном освещении люминесцентными лампами (освещенность Qi54,0 тыс.лк)/температуре 26-lc и относительной влажности воздуха 95Примечание: Сахарозы 20000 мг/л,рН 5,5.

Через 10-16 дней развившиеся каллусы переносят в жидкую среду В, содержание сахарозы в которой увеличивают до 25000-35000 мг/л и дополнительно вводят фитогормон - бензиламинопурии (ВАП) 0,2-0,8 мг/л. Материал инкубируют 6-8 дней в закрытых, прозрачных сосудах на встряхивающих аппаратах с числом оборотов 100125 при тех же параметрах освещенности, температуры и влажности, которые используют при инкубации листочков.

Образовавшиеся через 6-8 дней суспензии клеток используют для выделения изолированных протопластов или субкультивируют путем добавления к 1 объему свежей среды того же состава I объема суспензии и через 68 дней инкубации повторно используют для получения протопластов.

Предназначенную для выделения протопластов суспензию клеток центрифугируют (4-5 мин, 135-160 д). и после удаления супернатанта (надосадочная жидкость) добавляют к остав- шимся в осадке клеткам раствор ферментов с осмотиком, содержащий,вес.%

4,.0-5, О

Целлюлаза . 3,0-3,5 Пектиназа : Хлористый кальций ( )

5,0-5,5 Остальное Вода

Материал инкубируют в темноте При температуре в течение 12-,

100% в закрытых, прозрачных сосудах .

В случае появления на листочках бактериальной или грибной инфекции их удаляют с частью прилегающей к ним питательной среды. Состав среды приведен в табл.1.

Таблица

14 ч. Выделившиеся протопласты отделяют от грубых примесей путем фильтc рования через сетку с диаметром пор 100-125 мкм, а затем отмывают от раствора ферментов четырехкратным центрифугированием (4-5 мин, 135160 д), используя для промывки 5,05,5%-ный раствор хлористого кальция

0 {СаСЧ/. 6Н2О) . После центрифугирования и удаления супернатанта к изолированнЕ:1М протопластам добавляют жидкую среду Гамборга В, содержание сахарозы в которой увеличивают до

5 25000-35000 мг/л, дополнительно вводят осмотик - D-маннит - 8500095000 мг/л и фитогормоны: ауксин (2,4-D) из расчета 0,5-2,0 мг/л и цитокинин - БАП - 0,5-1,0 мг/л или кинетин - 1,0-2,0 мг/л, а рН среды доводят до 6,0.

Образовавшуюся суспензию протопластов для окончательной очистки от примесей фильтруют через фильтр с диаметром пор 80-90 мкм ч инкубируют в закрытых прозрачных сосудах 18-24 ч в темноте, а затем при непрерывном люминесцентном освещении (400600 лк), температуре и отно- сительной влажности воздуха 95-100%.

в течение инкубационного периода (24-30 дней) добавляют свежую питательную среду того же состава, но без осмотика и фитогормонов, в кото5 РУЮ дополнительно вводят аминокислоту-Ь-аспарагин из расчета 1200, 150р„ мг/л. Среду добавляют 5-7 раз .впервые через 6-7 дней после высева протопластов,а затем с интервалом 3 4 дня из расчета 1 объем свежей сре ды на 8-10 объемов суспензии. . После образования из протопласто многоклеточных колоний (более 32 кле ток в каждой) их переносят в свежую среду By/ в которой содержание сахар зы увеличивают до 60000-80000 мг/л, добавляют Ь-аспарагин-500-750 мг/л и фитогормоны- (2,4-Д)-1, 5-2,0 мг/л и кинетин - 1,5-2,0 мг/л. Пересадку осуществляют путем добавления к 4-6 объемам свежей среды 1 объема суспен зии с колониями. Материал инкубирую 18-24 ч при тех же параметрах, что и протопласты, а затем переносят на встряхивающие аппараты с числом оборотов 25-35 МИН ,Освещенность повышают до 2000-250,0 лк, другие парамет ры оставляют без изменений. Через 10-15 дней многоклеточные колонии образуют каллусы, которые пе ресаживают в свежую среду того же состава, при этом содержание сахарозы снижают до 40000-60000 мг/л, а в качестве фитогормона используют один бензиламинопурин в концентрации 0,20,8 мг/л. Пересадку осуществляют путем добавления к 4-6 объемам свежей . среды 1. объема суспензии с каллусами Материал инкубируют в закрытых.прозрачных сосудах на встряхивающих аппаратах с числом оборотов 100125 , освещенность повышают до 3000-4000 лк, Температуру и относите льную влажность воздуха оставляют без изменений. Через 10-12 дней на каллусах обра -зуются мелкие (200-500 мкм) зеленые эмбриоиды, которые пересаживают на свежую среду того же состава, но без 1,-аспарагина, содержание сахарозы снижают до 30000-40000 мг/л. Пересадку осуществляют путем добавления к 4-6 объемам свежей среды 1 объема суспензии с эмбриридами. Ма,те ртяал инкубируют при тех же параметра что и каллусы. Через 10-12 дней развиваются круп ные (1,0-2,5 мм) зеленые эмбриоиды, которые пересаживают на агаризованную среду В5 (6000-8000 мг/л бактоагара) без гормонов и добавок. Условия инкубации остаются прежними, но длину фотопериода сокращают до 16 ч в сутки. I.. . Через 15-20 дней развиваются проростки, котбрые пересаживают на агаризованную среду By с разбавленной (1;2 - 1:3) концентрацией всех входящих в нее компонентов и инкубируют при тех же условиях. По мере развития растений на этой среде и появления у них 2-3 тройчатых листьев и корней (через 20-30 дней) их пересаживают в почву и выращивают в обычных, условиях. Работу, связанную со,стерилизацией листьев получением протопластов и пересадками, проводят в асептических условиях. П р и м е р. Проводилась регенерация растений из протопластов, выделенных из клеток суспензионных культур люцерны гибридной сортов Рамблер, Зайкевича и желт„ой сорта Дединовская. При этом получены следукнцие результаты: 95% листочков,помещенных на питательную среду с тремя фитогормонами, через 14 дней образовали каллусы, которые помещали в жидкую питательную среду с О,,2 мг/л бензиламинопурина из расчета 20 мг каллусной ткани на 1 мл среды и инкубировали на аппарате АВУ-1 (аппарат универсальный для встряхивания жидкости . в колбах и пробирках) при 125 мин и амплитуде колебаний 20-30 мм. Через 7 дней из каллусов образовалась суспензия клеток, содержащая в среднем 120 тыс. клеток в 1 мл. Полученную суспензию после центрифугирования и удаления супернатанта использовали для выделения протопластов, добавляя к оставшимся в осащке клеткам раствор ферментов с осмотиком, содержащий,вес.%: целлюлазу Onozuka Р 1500-4,0, пектиназу Serva 3,5, хлористый кальций (СаСбд- )5,5 и дистиллированную воду - 87;О. Раствор стерилизовали фильтрованием через стеклянный фильтр 365 (Schott and Gen,Jena, DDR). Ha I CMзклеток оставшихся в осадке после центрифугирования, добавляли 1 мл ферментного раствора и инкубировали в чашках Петри -в темноте при температуре в течение 13 ч. Выделившиеся протопласты отделяли от рубых примесей путем фильтрования через трехслойную капроновую сетку с диаметром пор 125 мкм, а затем отмывгши от раствора ферментов четырехкратным центрифугированием .(5 мин, 135-160 д) , используя 5,5 %-ный раствор хлористого кальция (СаСВа. ) . к оставшимся в осадке протопластам добавляли жидкую среду с О-маннитом и фитогормонами: 1) 2,4-D-0,5 мг/л + БАП 1,0 мг/л 2) 2,4-D-2,0 мг/л + кинетин- 2, О мг/л и после фильтрования Суспензии через стеклянный фильтр ПС-1 высевали в чашки Петри (по 23 мл в чашку размером 60x12 или 60x15 мм). Конечная концентрация ротопластов составляла 40-60 ротопластов составляла 40-60 тыс. 1 мл.. Влияние возраста суспензионных культур клеток, состава и концентрации фитогормонов в питательной среде на выход жизнеспособных изолированных протопластов приведены в табл.2. Таким образом, оптимальный период Инкубации суспензионных культур, предназначенных для выделения прото пластов, составлял 6-8 дней. Наивол ший выход жизнеспособных протопластов наблюдался при использовании в качестве фитогормона бензиламинопур на в концентрации 0,2 мг/л. Изолиро ванные протопласты, полученные из суспензионных культур, растущих в среде без фитогормонов, имели низку жизнеспособность и были непригодны для культивирования. Значительное влияние на жизнеспо собность протопластов и темп клеточ ных делений оказывала концентрация фитогормонов в питательной среде, используемой для культивирования пр топластов. Снижение концентрации фи тогормонов до 0,1-0,2 мг/л приводило к замедленному на 2-3 недели) развитию многоклеточных колоний и кгшлусов. Увеличение концентрации фитогормонов до 3-4 мг/л вызывало нарушения в процессе клеточных деле ний, ингибировало развитие многокле точных колоний и кешлусов. Оптималь ные результаты были получены при ис пользовании фитогормонов в концентр ции 0,5-2,0 мг/л. В период образования из протопластов многоклеточных колоний (25 дней) к инкубируемому материалу доб ляли свежую среду, содержащую 1350 мг/л L-аспарагина. Первый раз среду добавляли через 7 дней после высева протопластов, а затем с 34-диевным интервалом еще 4 раза. Финальная концентрация аспарагина в инкубационной среде составляла 600 мг/л. Добавление свежей среды с 3-4дневными .интервалами повышало темп клеточных деления г то приводило к ускорению процесса развития многоклеточных колоний на 7-10 дней по сравнению с еженедельным добавлением среды. Уменьшение интервала межд добавками до 1-2 дней приводило к повреждению части клеток, вследст

Т а б л и ц а 2, вие резкого снижения осмотического давления питательной среды. Образовавшиеся колонии пересажи-. вали в свежую среду, содержащую 80000 мг/л сахарозы, 530 мг/л L-аспарагина, 2 мг/л 2,4-D и 2 мг/л кинетина путем добавления к 1 объему суспензии 4 объемов свежей среды и инкубировали 18 ч при тех же условиях, что и протопласты (с целью стабилизации осмотического давления), а затем переносили инкубируемый материал на аппарат для встряхивания с .круговым вращением Shake ТЛ/ BDR и культивировали при 30 мин-, освещенности 2100± iOO лк и температуре . Увеличение числа оборотов до 40-50 приводило к повреждению колоний и их выбрасыванию на стенки чашек, снижение до 10-20 мин уменьшало аэрацию питательной среды, в результате чего срок, необходимый для развития каллусов из многоклеточных колоний, удлинялся на 7-10 дней. Таким образом, оптимальнее число оборотов составляло 25-35 мин. Через 14 дней из многоклеточных колоний образовались каллусы,которые пересаживали в свежую среду,содержащую бОООО мг/л сахарозы, 530 мг/л Ii-аспарагина и 0,2 мг/л БАП (к б объемам свежей среды добавляли 1 объем суспензии с каллусами). Материал инкубировали на аппарате АВУ-1 при 125 мин и освещенности 3500 200 лк до образования в суспензии мелких, зеленых змбриоидов (10 дней). Суспензию с змбриоидами субкультивировали путем добавления свежей среды того же состава, нр без аспарагина С концентрацию сахарозы снижали до 40000 мг/л) и инкубировали в тех же условиях 10 дней. Значительное влияние на процессы развития из протопластов многоклеточных колоний, каллусов и эмбриоидов оказывало введение в питательную среду аминокислоты - аспарагина. Добавление этого) соединения увеличивсшо число образовавшихся колоНИИ в 1,75 раза по сравнению с конт-. ролем (среда без добавок). В контрольном варианте развитие продолжалось лишь до образования 8-16 клеточных колоний, которые впоследствии бурели.,Наряду с L-аспарагином, другая аминокислота - L-аргинин стимулировала образование многоклеточДобавление L-аспарагина стимулировало образование тканевых структур, из которых в дальнейшем развивались каллусы.-При инкубации каллу сов в питательной среде с аспарагин число образовавшихся эмбриоидов воз растсшо в 3 раза по сравнению с контрольным вариантом (среда без до бавок). Полученные эмбриоиды нормал но развивались в среде без аспараги Оптимальная концентрация L-аспарагина в инкубационной среде состав ляла 500-750 мг/л. Увеличение концентрации до 1000-1500 мг/л не повы шало зффективность действия аспарагина, а уменьшение до 100-250 мг/л приводило к замедленному (на 5-10 дней) образованию многоклеточных ко лоний, каллусов и эмбриоидов. Крупные, зеленые эмбриоиды перес живали на агаризованную среду бе гормонов, содержащую 30000 мг/л сахарозы и инкубировали при 16-часовом фотопериоде до образования проростков (17 дней). Проростки пересаживали на агаризованную среду гормонов с уменьшенной в 2 раза концентрацией всех компонентов. По мере развития из проростков растений с 2-3 листьями и корнями (2025 дней) их пересаживали в почву и выращивали в обычных условиях. Растения-регенеранты были свободны от фитопатогенной инфекции, нормально росли и развивались, цвели и завязывали семена от перекрестного опыления и самоопыления. Период регенер ции (от протопласта до растения) . составлял 95-100 дней. В расчете на 1 каллус было получено 300 растений. При высеве изолированных протопластов в питательную среду с двумя

ных колоний, однако для нормальнох-о прохождения процесса каллус®генеза &шо необходимо присутствие в питательной среде L-аспарагина.

Влияние аминокислот на развитие колоний, тканевых структур и эмбриоидов приведено в табл.3.

ТаблицаЗ сочетаниями фитогормонов (2,4-0 0,5 мг/л + БАП - 1,0 мг/л и 2,4-D 2,0 мг/л + кинетин - 2,0 мг/л) и последующего культивирования в одинаковых условиях были получены аналогичные результаты. Использование изобретения позволит значительно ускорить процесс регенерации растений из протопластов и повысить его эффективность. Высокий выход регенерантов позволит использовать данный способ в клеточной селекции, для генетической модификации растений, соматической гибридизации, ускоренного размножения и оздоровления растений и т.д. Формула изобретения 1. Способ регенерации растений люцерны in vitro, включающий получение каллусов и суспензий клеток с последующим выделением из них протопластов, и культивирование их в условиях, способствующих развитию многоклеточных колоний, каллусов, почек, змбриоидов и растений, о т - лич ающийся тем, что, с целью ускорения процесса регенерации растений и повышения его эффективности, протопласты выделяют из клеток суспензионных культур через 68 дней инкубации в среде с бензиламинопурином, изолированные протопласты инкубируют в жидкой питательной среде Гамборга Bj- с фитогормонами с добавлением каждые 3-4 дня свежей среды с L-аспарагином, а образовавшиеся многоклеточные колонии, пересаживают в свежую среду с фитогормонами и L-аспарагином и инкубируют на встряхивающих аттаратах с

числом оборотов 25-35 до образования каллусов, которые пересаживают в среду с бенэнламинопурином и L-аспарагином и инкубируют до образования эмбриоидов с последующей пересадкой их на среды, способствующие регенерации растений.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

3. O.Gamborg etaE ExperimentaE Cete Research 50, 1, p. 151-158, 1968.