Способ обнаружения вируса гепатита @ и антител к нему Советский патент 1984 года по МПК A61K39/12 

О5 Изобретение относится к эпидемиологии, преимущественно к способам диагностики вирусного гепатита. Известен способ обнаружения вируса гепатита А и антител к этому вирусу с использованием твердых полимеров в качестве носителя антител к вирусу гепатита А 1. Однако известный способ является очень трудоемким и сложным при выполнении и требует значительных затрат времени (около 40 ч). Цель изобретения - упрощение и ускорение способа. Поставленная цель достигается тем, что, согласно способу обнаружения вируса гепатита А и антител к нему путем проведеиия энзимоиммунологической реакции с использованием твердофазного носителя, в качестве последнего используют полистероловые щарики, покрытые антителами к вирусу гепатита А и хранящиеся в 1-5%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина в присутствии антибиотика широкого спектра действия при 4°С. Способ осуществляют следующим образом. Полистироловые шарики (в количестве от нескольких десятков до нескольких сотен в зависимости от-объема предстоящего исследования) помещают в сосуд с сывороткой рекновалесцента гепатита А, содержащий антитела к вирусу А в достаточно высоком титре, в подобранном опытным путем оптимальном разведении. При этом раствор должен полностью покрывать все шарики. В этом растворе шарики инкубируют 16 ч при 20°С, после чего их промывают 0,01 М раствором фосфатно-солевого буфера рН 7,4 в течение 3-5 мин и переносят их в сосуд с 1-5°/о-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в физиологическом растворе или 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,4, содержащем 10 ед/мл канамицина или другого антибиотика широкого спектра действия. Сосуд плотно укупоривают и хранят в бытовом холодильнике при 4°С в течение 6-8 мес. При необходимости шарики из раствора извлекают, однократно промывают 0,01 М ФСБ и используют в качестве специфического иммуносорбента вируса гепатита А в энзимоиммуносорбентом методе обнаружения этого вируса или антител к нему. Использование заранее покрытых антилелами к вирусу гепатита А полистироловых шариков, которые хранятся в 1-5%-ных растворах бычьего сывороточного альбумина, позволяет в 2 раза сократить продолжительность способа, а также упростить его, поскольку при этом отпадает необходимость специального покрытия шариков антителами и выдерживания их в растворе бычьего сывороточного альбумина (последнее обеспечивает снижение неспецифических результатов способа). Пример. Обнаружение вируса гепатита А (ВГА). 1-й этап - адсорбция анти-ВГА поверхностью полистироловых шариков и их длительное хранение с фиксированными к их поверхности анти-ВГА. Полистироловые шарики одинакового диаметра (5-7 мм) помещают в раствор сыворотки реконвалесцента гепатита А, содержащий анти-ВГА в достаточном титре. Цельную сыворотку разводят 0,01 М фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с рН 7,4. При этом оптимальное для адсорбции разведение сыворотки заранее подбирают опытным путем с помощью титрования ее в шахматном порядке. Шарики инкубируют в разведенной сыворотке при комнатной температуре (18-20°С) в течение 16-is ч, после чего их трехкратно промывают в растворе 0,01 М ФСБ, содержащем 0,05% твина-20, трижды меняя раствор через 3-5 мин. Затем шарики извлекают из раствора 0,01 М ФСБ с 0,05% твина-20 (ФСБ-Тв), помещают в 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина на 0,01 М ФСБ, содержащего в качестве консервантов пенициллин и стрептомицин в концентрации 5 ед/мл, и хранят в нем в укупоренных флаконах при 4°С в холодильнике в течение 3-4 мес. По мере необходимости шарики извлекают из указанного раствора и используют в качестве специфического иммуносорбента ВГА. 2-й этап - специфическая иммуносорбция ВГА из водной суспензии исследуемых фекалий. Шарики, покрытые анти-ВГА, извлекают из 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, где они хранились, промывают в течение 3 мин раствором ФСБ-Тв и помещают в пронумерованные стандартные стеклянные пробирки с внутренним диаметром 9 мм (по одному шарику в каждую пробирку). В пробирки вносят по 0,2 мл 10%ной водной суспензии исследуемых на присутствие ВГА фекалий. Одновременно в одну из пробирок вносят 0,2 мл 10%-ной водной суспензии фекалий, содержащих ВГА (контроль «положительных фекалий), а во вторую - 0,2 мл 10%-ной водной суспензии фекалий, не содержащих ВГА (контроль «отрицательных фекалий). В пробирках с суспензиями фекалий шарики инкубируют при комнатной температуре 1618 ч, после чего суспензии фекалий из пробирок отсасывают пастеровской пипеткой, а в пробирки вносят по 0,5 мл раствора ФСБ Тв и промывают в нем шарики 10-15 мин. Трижды меняя раствор через каждые 3-5 мин. Затем раствор ФСБ-Тв тщательно отсасывают. 3-й этап - выявление комплексов антиВГА-ВГА, фиксированных на поверхности полистироловых шариков. Анти-ВГА, меченные пероксидазой хрена альдегидным методом, используют в виде раствора в 0,01 М ФСБ, в разведениях от 1:100 до 1:600, в зависимости от содержания связанных с периксидазой анти-ВГА. В полученный раствор меченных анти-ВГА добавляют 2,5% нормальной сыворотки человека, не содержащей анти-ВГА, для устранения ложноположительных результатов. В пробирки с шариками, обработанными соответствующими суспензиями фекалий, вносят по 0,2 мл раствора меченных антиВГА и инкубируют шарики в этом растворе при комнатной температуре 2 ч. Затем раствор меченных анти-ВГА из пробирок отсасывают, а щарики промывают: в пробирки вносят по 0,5 мл раствора ФСБ-Тв, который дважды меняют сразу, после чего шарики промывают в течение 15 мин, трижды меняя раствор через каждые э мин. В конце промывки раствор ФСБ-Тв тщательно отсасывают, чтобы обеспечить быстрое высыхание шариков Наличие специфического присоединения меченных анти-ВГА к ВГА, фиксированному к твердой фазе, определяют путем обработки поверхности шариков раствором о-фенилендиамина, являюшегося субстратом пероксидазы. Во все приборы с высушенными шариками вносят по 0,2 мл 0,04 /0ного раствора о-фенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0) с добавлением 0,2% перекиси водорода и инкубируют шарики в этом растворе в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего во все пробирки вносят по 0,1 мл 2 М раствора серной или соляной кислот для остановки ферментативного окисления о-фенилендиамина и фиксации значений экстинкции растворов субстратов исследуемых образцов и контролей. Затем по очереди все пробирки помещают в гнездо штатива. В соседнее гнездо помещают пробирки с эталонными растворами 2,3-диаминофеназина с известными значениями экстинкции. Сравнивая интенсивность окраски раствора субстрата учитываемого образца с эталонными растворами в проходящем свете и подбирая пробирки с эталонными растворами, добиваются того, чтобы интенсивность окраски раствора субстрата учитываемого образца была визуально неотличима от интенсивности раствора в одной из эталонных пробирок. Экстинкцию раствора субстрата учитываемого образца считают равной экстинкции эталонного раствора, находящегося в указанной пробирке, подобранной визуальным сравнением. Аналогично сравнивают интенсивности окраски раствора субстрата всех исследуемых и двух контрольных образцов, определяя для каждого из них величину экстинкции. Результаты записывают, а затем вычисляют отношение экстинкции раствора субстрата каждого исследуемого образца к экстинкции раствора субстрата контрольного, отрицательного образца фекалий. Те образцы, для которых указанное отношение превыщает 2,1, считая положительными, т.е. содержащими ВГА. Обнаружение антител к вирусу гепатита А. Предварительно из каждой исследуемой сыворотки готовят два разведения на 0,01 М ФСБ - 1:20 и 1:200. 1-й этап осуществляют так же, как и при обнаружении ВГА. При покрытии поверхности шариков анти-ВГА два шарика используют для исследования каждой сыворотки (по одному шарику на два разве исследуемой сыворотки), а два шарика - на соответствующие контроли. 2-й этап. Шарики, покрытые анти-ВГА, извлекают из Р/о-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, где они хранились, промывают в течение 3 мин раствором ФСБ-Тв и помещают в пронумерованные пробирки, куда вносят по 0,2 мл Ш%-ной водной суспензии фекалий, содержащих ВГА, инкубируют при ко.мнатной температуре 16-18 ч. Затем суспензии фекалий из пробирок отсасывают, а шарики промывают: в пробирки вносят по 0,5 мл раствора ФСБТв и трижды меняют его через каждые 35 мин, после чего раствор тщательно отсасывают. По 0,2 мл из обоих разведений каждой из исследуемых сывороток вносят в отдельные пробирки и инкубируют в них шарики при 37°С 2 ч. Одновременно с этим в одну из пробирок вместо разведенной сыворотки вносят 0,2 мл чистого раствора 0,01 м ФСБ (контроль «положительных фекалий), а в другую - 0,2 мл сыворотки, не содержащей анти-ВГА, в разведении 1:20 (контроль «отрицательной сыворотки). По истечении времени инкубации растворы из всех пробирок отсасывают, а в пробирки вносят по 0,5 мл раствора ФСБ-Тв, в котором шарики трижды промывают по 3-5 мин каждый раз, после чего раствор удаляют. 3-й этап осуществляют так же, как и при обнаружении ВГА: во все пробирки с шариками вносят по 0,2 мл раствора меченных анти-ВГА и инкубируют в нем шарики при комнатной температуре 2 ч, после чего шарики 5 раз промывают раствором ФСБТв и сушат на воздухе. Затем в пробирки вносят по 0,2 мл 0,04%-ного раствора о-фенилендиамина и помещают пробирки в темноту на 30 мин при комнатной температуре, после чего в каждую пробирку вносят по 0,1 мл раствора 2 М серной или соляной кислоты.

Визуальный учет результатов осуществляют сравнением интенсивности окраски растворов субстрата всех исследуемых образцов, а также обоих контролен, как и согласно способу обнаружения ВГА, с набором эталонных растворов. Установленные экстинкции растворов субстрата всех обследуемых и контрольных образцов записывают. Экстинкцию раствора субстрата контрольного образца (контроль «отрицательной сыворотки) принимают за 100% связывания меченных анти-ВГА с ВГА, фиксированным к твердой фазе. Вычисляют проценты связывания меченных анти-ВГА с фиксированным ВГА, исходя из экстинкции растворов субстрата парных образцов исследуемой сыворотки, каждый из которых обрабатывали двумя соответствующими разведениями этой сыворотки (1:20 и 1:200). Затем путем интерполяции вычисляют титр сыворотки, в котором она обеспечивает 50%-ное блокирование процесса связывания меченных анти-ВГА с фиксированным ВГА.

Например, при исследовании неизвестной сыворотки в разведениях 1:20 и 1:200 получили следующие величины экстинкции растворов субстрата: контрольного образца (контроль «отрицательной сыворотки) 0,9; образцов, обработанных исследуемой -сывороткой в разведениях 1:20 и 1:200, соответственно 0,2 и 0,5. Принимая экстинкцию 0,9 за , вычисляют проценты связывания для обоих образцов, которые соответственно равны 22,2 и 55,5% связывания меченных анти-ВГА с фиксированным ВГА. Интерполируя, получают значение титра исследуемой сыворотки 1:130.

Приготовление набора эталонных растворов 2,3-диаминофеназина с известными значениями оптической Плотности.

Готовят исходный раствор 2,3-диаминофеназина . В 15,0 мл 0,04%-ного раствора о-фенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0) вносят 30 мкл 30%-ного раствора перекиси водорода и 0,5 мг пероксидазы хрена и инкубируют 1 ч на свету при комнатной температуре, после чего в полученный окрашенный раствор вносят 7,5 мл 2 М раствора серной кислоты.

Из исходного раствора готовят серийные разведения в 0,66 М растворе серной кислоты в цитратно-фосфатном буфере от 1:1 до 1:1024. Фотометрируя эти растворы при длине волны 492 нм, строят калибровочную кривую зависимости величины экстинкции от разведения исходного раствора. Исходя из полученной калибровочной кривой готовят разведение исходного раствора 2,3-диаминофеназина со значениями экстинкции от 0,1 до 1,5 (всего 15 растворов). Каждый из полученных растворов фотометрируют при длине волн 492 нм для контроля

величины экстинкции полученных разведений исходного раствора. Каждый из полученных растворов разливают по 0,4 мл в стеклянные пробирки с внутренним диаметром 9 мм и запаивают над пламенем спиртовки.

Отмывание поверхности полистироловых щариков, использованных в энзимоиммуносортентном способе обнаружения ВГА и анти-ВГА.

Использованные шарики, трижды промытые дистиллированной водой, помещают в плоскодонную колбу с 1%-ным раствором додецилсульфата натрия в дистиллированной воде (объем раствора рассчитывают исходя из того, что на промывание 1 шарика расходуется 5 мл раствора). Колбу с раствором, в который погружены шарики, несколько раз встряхивают, после чего раствор сливают. Эту процедуру повторяют 3 раза. Раствор меняют. В свежем растворе

додецилсульфата натрия шарики инкубируют при комнатной температуре в течение 24 ч. Шарики извлекают из колбы, трижды промывают дистиллированной водой в течение 15 мин, после чего ополаскивают дистиллированной водой 10-15 раз, меняя каждый раз воду в колбе. Затем шарики извлекают из колбы, помещают на фильтровальную бумагу и сушат на воздухе. Высушенные шарики могут использоваться в качестве твердой фазы.

Предлагаемый способ обнаружения ВГА и анти-ВГА прост в исполнении и может быть осуществлен на базе неспециализированной типовой вирусологической лаборатории (например, санэпидстанции) одним исполнителем. Полистиролевые шарики широко используются в качестве сырьевого материала в производстве многих пластмассовых изделий и являются дешевым и общедоступным продуктом, не требующим специального изготовления. Кроме того, возQ можность полностью отмывать поверхность использованных при энзимоиммуносорбентном способе щариков от иммунных комплексов с помощью доступного детергента позволяет использовать такие шарики неоднократно.

5 Способ не требует использования дорогих микропипеток, так как рабочие объемы реагентов, относительно велики и могут быть получены с помощью стеклянных градуированных пипеток для щприцев объемами 1,0 мл. Стеклянные пробирки диаметром 9 мм выпускаются промышленностью и используются во многих лабораториях биологического и медицинского профиля.

Объективный визуальный учет результатов исследования с помощью предлагае5 мого способа позволяет обходиться без спектрофотометра и использовать способ в неспециализированных лабораториях практического профиля в непосредственной близости от очагов инфекции. При этом точность, обеспечиваемая визуальным учетом результатов, сопоставима с точностью известного способа и достаточна для объективной оценки данных, получаемых в полевых условиях. Возможность длительного (6-8 мес) хранения в бытовом холодильнике полистироловых шариков, покрытых анти-ВГА, позволйет одновременно покрывать антителами значительные количества шариков, заготовляя их впрок, транспортировать и использовать их в качестве специфического иммуносорбёнта ВГА в условиях неспециализированной лаборатории или даже вне ее, в полевых условиях. Это сокращает затраты времени на 16-18 ч на осушествление способа в момент самого исследования, что весьма важно в условиях эпидемиологических исследований вспышек вирусного гепатита А и необхрдимости быстрой разработки рациональной тактики борьбь с инфекцией. Кроме того, процесс хранения шариков, покрытых анти-ВГА, е растворе бычьего сывороточного альбумина сам по себе обеспечивает устранение части неспецифических результатов, исключая необходимость выдерживания покрытых анти-ВГА шариков в растворе бычьего сывороточного альбумина в течение 2 ч, как это предусматривается известным энзимоиммуносорбентным способом, что, соответственно, сокращает время, затрачиваемое на все исследование. Все это не только сокращает время исследования, но и сушественно методически упрощает его. Предлагаемый способ обнаружения ВГА может использоваться не только для исследования фекалий, но и для исследования на наличие ВГА объектов внешней среды и продуктов питания, что имеет немаловажное значение при эпидемиологическом анализе вспышек гепатита А и выяснении путей передачи этой инфекции. Принцип предлагаемого способа может стать методической основой для разработки аналогичных способов обнаружения других вирусов и антител к этим вирусам. Таким образом, предлагаемый способ обнаружения БГА и анти-ВГА по сравнению с известным является более простым, быстрым и дешевым.

СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А И АНТИТЕЛ К НЕМУ путем проведения энзимоиммунологической реакции с использованием твердофазного носителя, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения его, в качестве твердофазного носителя используют полистироловые шарики, покрытые антителами к вирусу гепатита А и хранящиеся в 1-5%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина в присутствии антибиотика широкого спектра действия при 4°С.