Способ прогнозирования течения реконвалесцентного периода острого вирусного гепатита В у детей Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, ка- области гепатологии, в частности вопросов диагностики течения периода рекой валесценции острого вирусного гепатита В (ОВГВ).

Целью является повышение специфичности диагностики.

Способ осуществляется следующим об- .

Методика постановки иммунофермент- ноф анализа

В лунки платы вносят 100 мл разведенного в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) рН 7,4 липопротеида печени человека (ЛПЧ) и инкубируют 10-16 часов при +4 - +10°С,

Отклеивают плату от несвязавшегося антигена ФСБ рН 7,4. Во всех последующих

стадиях отмывку проводят тем же реагентом.

В лунки платы помещают по 100 мл предварительно разведенной в ФСБ рН 7,4 от 1:400 до 1:10800 (с шагом 1/3) исследуемой сыворотки больного и отрицательного контроля (пул сывороток здоровых доноров). Инкубируют 10-16 ч при 4-10°С.

Удаляют избыток образцов из лунок. Плату отмывают.

В. лунки вносят 1.00 мкл конъюгата (им- муноглобулинов; меченных пероксидазой), разведенного в растворе 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), приготовленного на ФСБ рН 7,4. Инкубируют 1 ч при 37°С.

Удаляют избыток конъюгата из лунок, плату отмывают.

00

о

ю

(А Ю

4

Помещают в лунки по 100 мкл субстратной смеси (перекиси водорода и 5-аминоса- лициловой кислоты). Инкубируют плату 1 ч при комнатной температуре.

Результаты определяют на фотометре при длине волны 450 мм. Если титр антител снижается ниже 1:3600(1:1200, 1:400, меньше 1:400) это показатель неблагоприятного течения реконвалесцентного периода. Если титр повышается выше 1:3600 (1:10800, 1:32400) - это указывает на благоприятное течение периода реконвалесценции ОВГВ,

Положительный эффект, достигаемый при использовании изобретения, заключается в повышении достоверности диагностики благоприятного и неблагоприятного течения периода реконвалесценции при ОВГВ у детей.

Было обследовано 33 ребенка больных ВГВ, у которых в результате диспансерного наблюдения по совокупности общепринятых клинико-биохимическим критериям, вы- явили благоприятный (21 ребенок) и неблагоприятный (12 детей) течение перио- да реконвалесценции ВГВ.

Как следует из данных, ложноположи- тельное повышение показателей активности АлАТ при благоприятной реконвалесценции отмечается в 9 из 21 случая, т.е. в 43 ±11%, а ложноотрицательные показатели активности АлАТ при неблагоприятной реконвалесценции отмечается в 5 из 12 случаев, т.е. 33 ± 14%. Следовательно правильный Ответ с помощью способа-прототипа был получен в 20 из 33 случаев, т.е. 60 ±9%.

С помощью нового способа,правильный ответ был достигнут в диагностике благоприятного варианта реконвалесцентного периода в 20 случаев, т.е. в 95%, а в диагностике неблагоприятного варианта в 11 случаев, т.е. 91%.

Таким образом, с помощью нового способа правильный диагноз основных вариантов реконвалесцентного периода был установлен в 31 случаев, т.е. в 93% ±3%.

В процессе разработки нового способа экспериментально были исследованы следующие этапы его осуществления:

Оптимальные условия связывания антигена путем пассивной адсорбции были достигнуты при использовании фосфатно- солевого буфера (ФСБ) рН 7,4. Инкубация при +4 - +10°С в течение 10-14 часов сведений к минимуму колебания в содержании связанного антигена, что дает хорошую воспроизводимость результатов;

при использовании физиологического раствора с добавкой 0,05% твин-20 связывания антигена с подложкой не происходило,

Применение 0,01 М карбонатного буфера рН 9,5 требовало большего, чем в случае

с ФСБ количества антигена (в 2,5 раза), что приводило к увеличению числа ложнополо- жительных результатов, появлению фона.

Таким образом, оптимальных результатов при связывании антигена с поверхностью платы можно достигнуть лишь при использовании ФСБ рН 7,4.

После сорбции для отмывки от избытка антигена наиболее приемлемым оказался ФСБ рН 7,4. Использование в качестве добавки к нему твин-20 или замена его физиологическим раствором приводили к частичному снятию антигена с подложки, что приводило к увеличению фона и снижению воспроизводимости анализов.

Предварительное разведение исследуемых образцов до 1:400 с последующим шагом титрования позволяет надежно проводить инситирование антител в подходящем диагнозе концентраций с достаточной точностью определения.

Шаг титрования 1 /2 не позволяет с достаточной степенью точности проводить дифференцию образцов. ,

Шаг титрования 1/5 приводит к сужению возможности точного определения прогностически значимых титров.

Исследуемые образцы инкубировали 10-14 часов при +4 - +10°С что позволило снизить уровень неспецифического связывания увеличить чувствительность метода,

П р и м е р 1. Ребенок П., 4-х лет,

№ дисп.карты 1721, с диагнозом вирусного

гепатита В, В периоде реконвалесценции

жалобы отсутствуют, размеры печени в пределах нормы, При определении титра антител к протеидному антигену печени класса IgM, он был равен 1:3600, что послужило обоснованием для диагноза благоприятного варианта течения реконвалесценции

больной. Однако активность аланинами- нотрансферазы (АлАТ) выявилось 70 усл.ед. (норма до 50 усл.ед.), что бы дало основание предполагать неблагоприятный вариант течения реконвалесценции.

Последующим диспансерным наблюдением в течение полугода установлено отсутствие субъективных и объективных проявлений наличия патологического процесса печени, в частности нормализовалась АлАТ, тимоловая

и сулемовая пробы. Ребенок признан здоровым. Тем самым подтверждена правильность диагноза благоприятного варианта реконвалесценции после перенесенного вирусного гепатита В.

П р и м е р 2. Ребенок В., 3 года, № диспансерной карты 2114, с диагнозом вирусного гепатита В, период реконвалес- ценцйи.

Ребенок, кроме ускоренной усталости, жало(ры не предъявлял, печень - нижний край е выступал на 0,5 см, по правой сосковой линии.

При определении титра антител к про- теидюму антигену класса М, он оказался повышенным, равным 1:10000. На этом основании был выставлен диагноз - благоприятный варианттечения реконвалесцентного периода болезни.

Однако активность АлАТ - 190 усл.ед. (норма до 50 усл.ед.). Это дало повод пред- полохить диагноз неблагоприятного варианта ечения периода реконвалесценции.

Последующим диспансерным наблюдением в течение 7 месяцев была отмече- на нормализация активности АлАТ при нормальном содержании проведенных коллоидно-осадочных проб и билирубина, на ффне отсутствия субъективных и объек- тивнЦх данных патологического процесса. Такщ образом, была подтверждена достоверности диагноза благоприятного варианта реконвалесцентного периода у ребенка после перенесенного ВГВ, поставленного с помощью нового способа.

Показано, что диагноз благоприятного реконвалесцентного периода ВГВ был под- твер4ден в результате длительности 6-8 месяцев диспансеризации детей с учетом отсутствия клинико-биохимических призна- ков а тивности патологического процесса. С способа-прототипа правильный диагноз благоприятного варианта реконва- лесце нтного периода В ГВ был установлен у 12 , из 21 ребенка, т.е. только 57 ± 11 %

случаев, у которых активность АлАт находилась в пределах нормы. У остальных 9 рекон- валесцентов активность АлАТ находилась выше нормы (65-195 усл.ед.). При учете титра антител к протеидному антигену печени класса IgM, правильный ответ получен в 15 из 21 случая, 14,4%, т.е. Р 0,5. Только при использовании нового способа путем определения антител к протеидному белку печени класса IgM в 20 случаев был правильно диагностирован благоприятный вариант реконвалесценции ВГВ.

Формула изобретения Сггособ прогнозирования течения реконвалесцентного периода острого вирусного гепатита В у детей путем исследования сывороток крови больных, отличающий- с я тем, что, с целью повышения точности способа, в первые 3-6 месяцев периода реконвалесценции определяют величину титров антител IgM класса к липопротеиду печени человека с помощью иммунофер- ментного анализа, при этом посадку липоп- ротеида на полистироловые планшеты проводят в фосфатно-солевом буфере с рН 7,4, сыворотку больного раститровыванную с шагом 1 /3, инкубируют 10-14 ч при температуре 4-10°С, отмывают фосфатно-соле- вым буфером с рН ,4, в качестве коньюгата используют иммуноглобулины класса IgM, меченные пероксидазой и связывание коньюгата с антителами проводят в 1 %-ном растворе бычьего сывороточного альбумина, приготовленного на фосфатно-солевом буфере с рН 7,4, и при титрах антител 1:3600 - 1:10800 прогнозируют благоприятное тече- . ние реконвалесценции, а при титрах 1:400- 1:1200 прогнозируют неблагоприятное течение реконвалесценции вирусного гепатита В.

Изобретение относится к медицине, в частности к гепатологии, и может быть использовано для прогнозирования течения реконвалесцентного периода острого гепатита у детей. Цель - повышение точности спфсоба. Для этого в первые 3-6 месяца периода реконвалесценции определяют величину титров антител IgM класса к липоп- ротеиду печени человека, при этом посадку липопротеида на полистироловые планшеты проводят в фосфатно-солевом буфере рН 7,4, при получении первичного комплекса антиген-антитело сыворотку больного рас- титровывают с шагом 1/3, инкубируют 10- 14 ч при температуре 4-10°С, отмывку проводят фосфатно-солевым буфером рН 7,4, в качестве конъюгата используют им- муноглобулины класса IgM, меченные пе- роксидазой, связывание конъюгата с антителами проводят в 1% растворе овечьего сывороточного альбумина, приготовленного на фосфатно-еолевом буфере рН 7,4, при титрах антител 1,3600-1:10800 диагностируют благоприятное течение реконвалесценции, а при титрах 1:400-1:1200 диагностируют неблагоприятное течение реконвалесценции вирусного гепатита В. ел с