Способ определения ротавирусных антигенов Советский патент 1991 года по МПК C12N7/00 G01N33/53 

Изобретение относится к вирусологии и может найти применение при диагностике острых вирусных инфекций.

Цель изобретения - упрощение мето- да, повыиение чувствительности.

Исследуемый материал наносят на мембранные фильтры отечественного производства, характеризующиеся равномерным распределением гидрофобных участков, обеспечивающие прочную фиксацию антигена за короткое время путем физической адсорбции и исключающие колебания в количестве связывающегося белка на разных участках носителя и потерю их на последующих этапах анализа Проводят инкубацию с

бычьим сывороточным альбумином и выполняют разведения всех реагентов на калий-калиевом фосфатном буферном растворе с бычьим сывороточным альбумином, промывают фильтры на всех этапах анализа этим же буферным раствором с включением детергента - твин 20, что позволяет уменьшить неспецифическое связывание о Используют антипероксидазные антитела в комплексе с пероксидазой на стадии сформировавшегося комплекса антиген-антитело-антивидовое антитело, приводящего к связыванию фермента через антитела к ферменту, что повышает чувствительность способа Осуществляют анализ по принципу погружения носителя в растворыо

Основанием для выбора твердого носителя, состава буферного раствора для разведения реагентов и отмывки носителя, условий проведения этапов анализа, длительности стадии инкубации служат экспериментальные исследования, результаты которых представлены в табл 1 „

Как видно из представленных в таблице данных, мембранные фильтры Дес- нянского производства не уступают по сорбционной способности фильтрам за- рубежногр производства

Введение ферментной метки типа антипероксидазных антител в комплексе с пероксидазой позволяет увеличить число положительных находок в исследуемом материале в 1,5 раза Ротавирусный антиген обнаруживают с одинаковой частотой при инкубации в течение 18 ч при 4°С и в условиях термостата - в течение 1-2 ч

Анализ приведенных данных свидетельствует такке о целесообразности использования при осуществлении анализа 0,15-0,2М калий-калиевого фосфатного буфера рН 7,5, так как применение этого буфера позволяет обнаружить наибольшее число положительных проб

Существенное значение оказывает и введение стадии инкубации твердого носителя в буферном растворе с 1,5- 2,0% бычьего сывороточного альбумина, повышая процент обнаружения рота- вирусных антигенов в сравнении с данными , когда эта стадия не вводится

В качестве исследуемого материала берут фекалии больных острыми кишечными инфекциями в виде фильтратов 10%

5

0

5

0

5

0

5

0

5

суспензии исходной пробы или нефильтрованных суспензий, собранных не позднее пятого дня от начала заболевания и приготовленных по общепринятой методике

Способ осуществляется следующим образом и состоит из двух этапов: подготовительного и основного о

Подготовительный этап включает: определение размера фильтра для проведения исследования, разметку и шифровку; размножение вирусов на культуре клеток с целью получения антигенов (положительный и отрицательный контроль) ; приготовление калий-калиевого фосфатного буферного раствора и трис- НС1; приготовление необходимых разведений реагентов, используемых в анализе

В работу берутся мембранный фильтр № 1 - № 2 с размерами пор 0,2-0,6/Мтп Деснянского производства диаметром 9,5 см при исследовании большого числа образцов одновременно (более 400) или часть его, либо число проб невелико „ На глянцевой стороне фильтра простым карандашом обозначают номер и ставят метку в виде точки (или черточки) , указывающей порядок нанесения исследуемых проб

На матовой поверхности фильтра шляпкой гвоздя 50 мм отмечают кружочки-метки на расстоянии 1 мм одна от другой, располагая метки по прямой линии „ В каждый,из них тонко оттянутой пастеровской пипеткой или пипеткой- дозатором в виде нерастекаюцейся капли вносят 1-2 мкл исследуемого материала Ноыер образца записывают в рабочем журнале в такой последовательности, как вносят на фильтр

На каждый фильтр наносят положительный и отрицательный контроля , Место нанесения определяет исследователь В качестве контролен используют вируссодержащую культуральную жидкость, освобожденную от. клеточного детрита центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 мин. Заражающая доза вируса, выбор культуры клеток, состав ростовой и поддерживающей среды, условия накопления вируса соответствуют общепринятым для культивируемого вируса. Для получения ротави- русного антигена (положительный контроль) ротавирусом SA-II инфицируют перевиваемые линии клеток почек зеле- ной мартышки, а для получения полиовирусного антигена (отрицательный контроль) вакцинным штампом вируса полиомиелита типа ГЦ заражают Нер-2

Положительный и отрицательный кон- троли в опыт берут в двух разведениях цельный и 1:10„

Калий-калиевый фосфатный буферным .раствор готовят 0,15-Q2M pH 7,5 с использованием 2М на его основе готовят раствор с 1,5-2,0% бычьим сывороточным альбумином для приготовления разведений реагентов и с 0,05% твин-20 для промывки фильтра после каждого этапа анализа.

Разведения иммуной сыворотки, диагностических антител против глобулинов кролика, антител антипер окси- дазы в комплексе с пероксидазой выполняют согласно наставлениям,

Для приготовления раствора субстрата готовят 0,5И трис-HCl рН 7,5а Трис-HCl доводят до кипения, вносят субстрат - диаминобензичин из расчета 0,4 мг/iui и после охлаждения добавляют 5 мкл/мл 3%-ной перекиси водорода

Способ определения ротавирусных антигенов осуществляют следующим образом

На мембранные фильтры №1 - №2 с размером пор 0, 2-G,6ium ДеснянсУого производства наносят по 1-2 мкл исслдуемого материала и два контроля (положительный и отрицательный)t Выдерживают при комнатной температуре до высушивания и погружают в буферный раствор с 1,5-2,0% бычьего сывороточного альбумина, Инкубируют при 37°С в течение 1 ч, сливают буфер и замораживают его для повторного использования„

Фильтр погружают в раствор кроличьей иммуной сыворотки в отношении ротавируса SA-II в рабочем разведении. Инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Имунную сыворотку сливают и замораживают, а фильтр трижды отмывают в буферном растворе с 0,05% твин-20„

Затем фильтр погружают в раствор диагностических антител против глуби линов кролика в раОочем разведении. Выдерживают при 37°С в течение 1 ч, сыворотку сливают и замораживают, а фильтр трижды отмывают по 4 мин в буфере с 0,05% твин-20,

Фильтр погружают в раствор анти- пероксидазных антител в комплексе с пероксидазой в рабочем разведении.

45298

637°С

в течение 1 ч,

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Инкубируют при сливают раствор комплекса и замораживают . Фильтр трижды отмывают в буферном растворе с 0,05% твин-20 и погружают в свежеприготовленный раствор диаминобензидина„

Через 3-5 мин после светло-коричневого окрашивания положительного контроля иммунохимическую реакцию останавливают, погружая фильтр в дистиллированную воду „

Учет проводят визуально после подсушивания на фильтровальной бумаге Предлагаемым способом обследуют 164 больных острыми кишечными инфекциями в период спорадической заболеваемости и 66 больных из очагов о

Сравнительные данные определения ротавирусных антигенов в инфекционном материале от больных предлагаемым и известным способом представлены в табло 2«,

Как видно из представленных данных, при исследовании инфекционного материала предлагаемым способом ротавирус- ный антиген определяют в 1,5 раза чаце при обследовании спорадических больных и в 1,1 раза в период групповых заболевании, сокращая время анализа в 4,4-6 раз (разница показателей статистически достоверна)„

-, Техника постановки анализа позволяет повторно (до 5 раз) использовать дорогостояще реагенты, что значительно снимает экономические затраты (табл„ 3) „

Уормула изобретения

Способ определения ротавирусных антигенов, включаюций взаимодействие антител с иммобилизованным на носителе антигеном с использованием ферментной метки и буферного раствора с последующей оценкой результатов, отличающийся тем, что, с целью упрощения метода и повышения чувствительности, взаимодействие осуществляют путем погружения носителя в растворы реагентов, при этом в качестве носителя используют мембранный фильтр, в качестве ферментной метки используют антипероксидазные анти- тела в комплексе с пероксидазой, в качестве буфера используют 0,15-О,2М калий-калиевый фосфатный буфер с 1,5- 2,0% бычьего сывороточного альбумина.

зm

ь

им

он47

47 47

47 47 47

8

5 10

17 17

47 47

12 17

8 8

6 6

5 5

О О

8 8

7 8

5 5

О О

1645298

10

Продолжение табл.1

JL

Изобретение относится к вирусологии и мохет найти применение при диагностике острых вирусных инфекций, Целью изобретения является упрощение метода, повыпение чувствительности„ Для этого исследуемый материал наносят на мембранный фильтр с размером пор 0,2-0,6 мкм, инкубируют в буферном растворе с бычьим сывороточньм альбумином и на этом растворе выполняют разведения реагентов, этапы исследования осуцествляют путем погружения фильтров в соответствующие растворы, в качестве ферментной метки применяют антипероксидазные антитела в комплексе с пероксидазон, учет реакции производится визуально через 4-5 ч о Преимуществом предлагаемого способа является упрощение, повышение результативности в 1,1-1,5 раза, сокращение сроков исследования в 4,4-6 раз, снижение затрат на реагенты в 28 раз. 3 табл. g tiafr 1В 2 СЛ ьэ СЈ х

Условия проведения анализа

инфекционного материала от больных

В ТоЧ С

положительнымрезультатом

2,0% 17 8 8 5 О

3,0% 17 8 8 5 О

Не вводили 47 10 8 6 5.0 Тип ферментной метки

Антитела диагностические против глобулинов кроликов, меченные пероксидазой47 11 8 4 5 О

Антитела антиперок- сидазные в комплексе с пероксидаэой 47 17 8 8 5 О

-Таблица2

Контингент обследованных Обнаружение ротавирусных антигенов в пробах

через, ч

( 4-5у 22-24

Предлагаемый способ Известный способ

Всего обсл„|В ТоЧ. с поло- Всего обсл. В т.ч. с I жительным рез.положите|льным рез.

Спорадические больные164 38,4 + 3,8162 2,7,2+3,5

Больные иэ очагов66 55+6 . 71 48+6

Таблица 3

Расчет-обоснование экономической эффективности предлагаемого способа определения ротавирусных антигенов

РеагентКоличество реагентовСнижение затнеобходимое ис-рат в (раз)

следования 100 об-при использоразцов, мя вании реагенспособт

..- т-Один I МногоПредлагве- Жзвест-раз I кратно мый | ный(5)

Иммуилая сыворотка 5 28 5,6 28 Диагностические антитела против глубудинов кролика 5 28 5,6 28 Субстрат5 28 5,6

Исследовано образцов

серий полиовирус- ного антигена (отрицательный контроль)

бс.ч.,

В Г„Чо С

положительнымрезультатом

абс.Чо

в т.ч. с положительным результатом