Полипептиды на основе @ -лизина в качестве компонентов полипептидного комплекса,полипептидные комплексы на основе @ -лизина в качестве антигенной детерминанты диагностикума и способ получения эритроцитарного диагностикума Советский патент 1986 года по МПК C08G69/10 G01N33/53 

NH- CH-CO)jr-(NH- СН-СО)р .(СН2)4(СН2)2:

Ш2СЩ

где k 15-50 при Р О, а k х,

k: р 1:1 при k + Р х с мол.м. 340 - 6.-Ю в качестве антигенной детерминанты диагностикума,

3, Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления антител, специфичных к биологически активным полипептидам, путем кова.лентного связывания антигенной дётер минанты с формализированными эритроцитами барана с помощью альдегида, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности диагностикума к биологическим актив11ЫМ L-лизинсодержащим полипептидам.

70885

один объем эритроцитов барана обрабатывают 5-8 объемами 3-5%-ного раствора формальдегида в фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 в течение 20-24 ч при 4-6°Cjобработанные эритроциты отделяют, вновь обрабатывают 2,02,5 объемами 36-40%-ного раствора формальдегида в том же буфере при 4-6 С в течение 20 ч, 18-20%-ную суспензию полученных формапизированных эритроцитов в том же буфере обрабатывают растворами полипептидных комплексов на основе Е-лизина в физиологическом растворе с концентрацией 10-20 мг/мл из расчета 5-9 объемов раствора комплекса на один объем эритроцитов, к смеси добавляют 0,02 мл 12-15%-ного раствора глутарового альдегида, смесь вьщерживают 2-2,5 ч при 36-38 С .и 10-12 ч при 4-6°С при постоянном перемешивании, осадок отмывают физиологическим раствором и отделяют центрифугированием.

1. Полипептиды на основе L-лизина общей формулы СЛ соон СО-(СН2)2-СООН со-(СН2 -соои :п 1-9:4:1 при (Г+т):п 1:1, Т:т с мол.м. 1,9-10-8«10, аТ + т + п х 2. Полипептидные комплексы на осiHOBe L-лизина обп1ей формулы Г Т®Г 1® , .с мол.м. 1, 4-10, где CH-CO -4Wl-CH-C 0) СН2)4(СН2)2 NHСООН

Изобретение относится к области химии полимеров и медицины, а именно к полипептидам на основе L-лизина, комплек;сам на основе полипептидов L-лизина в качестве антигенной детерминанты диагностикума и к способу получения эритроцитарных диагностикумо

Указанные соединения неизвестны, и их свойства в литературе не описаны.

Известен способ получения эритроцитарного диагно стикума для выявления антител, специфичных к биологически активным полипептидам путем ковалентногхэ связывания антигенной детерминанты с формализированными эритроцитами барана, S котором фррмализированные эритроциты обрабатываю антигеном в присутствии бис- диазобензидина в барбиталоврм буфере.

Недостаток способа - невысокая специфичность диагностикума к биологически активным L-лизинсодержащим полипептидам.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результата.м является способ получения эритроцитарного диагностикума дяя выявления

антител, специфичных к биологически активным полипептидам путем ковалентного связывания антигенной детермиранты.с формализированными эритроцитами барома с помощью альдегида, в котором эритроциты смещивают с глутаровым альдегидом, -добавляют обработанный бис-диазобензидином антиген и промывают фосфатным буфером.

Недостаток способа заключается также в невысокой специфичности диагностикума к биологически активным L-лизинсодержащим полипептидам.

Целью изобретения является повышение специфичности диагностикума к биологически активным L-лизинсодержащим полипептидам.

Поставленная цель достигается

новой структурой полипептидов на основе L-лизина общей формулы

4NH-CH-COV-6NH-CH-COfer(NH-CH-CO)R

(CHj)

(снг),

(снг),

соон

NH СО-(СН2)2-СООН

NHz

где I:m 1:4-19 при n 0;

T:m:n 1-9:4:1 при (I+m). с мол.м. ЗЮ - S-IO, которые служат компонентами комплекса, -новой структурой полипептидных комплекi NH-CH-COV-(NH- CH-CO)5n-{NH-CH-CO

л

(СН2)4 Ш2

с мол.м. 1 , 8-10,

где I:m 1:4-19 при n О,

а f + m X,

T:m:n 1-9:4:1 при (I+m):n

al+m+n x.

-f NH-CH-CO) NH-СН-СО

(CH2)4

(CH2)2 COOH

Шс

jc 15-50 при p . 0, k x; .k:p .1:1 при k + p x с мол.м. 3-10 - , которые являются антигенной детерминантой эритроцитного диагностикзгма, а также тем, что в способе получения эритроцитарного диагностикума для выявления антител к биологически активным полипептидам путем ковалентного связьюания антигенной детерминанты с формализированными эритроцитами барана с помощью альдегида один объем эритроцитов барана обрабатывают 5-8 объемами 3-5%-ного раствора формальдегида в фосфатном буфере с рН 7,27,4 в течение 20-24 ч при 4-6°С, обработанные эритроциты отделяют, внов обрабатывают 2,0-2,5 объемами 3640%-ного раствора формальдегида в том же буфере при 4-6°С в течение 20 ч, 18-20%-ную суспензию полученных формализированных эритроцитов в том же буфере обрабатывают растаором полипептидных комплексов на основе L-лизина в физиологическом растворе концентрации 10-20 мг/мл из расчета 3-9 объемов раствора комплекса на один объем эритроцитов, к смеси добавляют 0,02 мл 12-15%ного раствора глутарового альдегида смесь выдерживают 2-2,5 ч при 36З8с и 10-12 ч при при посто4

основе .t- лизина общек

|- -.Bf- -,Ф

ГАЬ.{В

1,410- 4-10 , где

(СН2)2

(СН2)4

соон NH

со-(сн2)

янном перемешивании, осадок отмывают физиологическим раствором и отделяют центрифугированием,; Пример 1. К раствору

0,125 г поли-Ъ-лизина в 25 мл 0,1 м фосфатного буфера с рН 6,5, охлажденному до 0-5С, при перемешивании добавляли раствор 1 г янтарного, ангидрида в 10 мл диоксана. При этом рН раствора поддерживали добавлением 10%-ного раствора NaOH в пределах 6,5-6,8.. После добавления всего количества янтарного ангидрида смесь перемешивали еще 1 ч при 0-5 С, затем выдерживали сутки в холодильнике. После проведения диализа против воды сополимер вьщеляли лиофилизацией I:m 1:4-19, n О, мол.м, 8ilO . Содержание азота

(элементный анализ), %: 8,74; 8,85. Это соответствует 80-82% замещению аминогрупп в исходном полимере поли-Ь-лизине.

Пример 2.В условиях примера 1 из поли-Ъ-лизина с мол.м.

1,910 получали полипептид,имеющий 1:га 2:13 с мол.м. 3,2,ТО. Содержание азота (элементный анализ),%: 10,38; 10,40, что соответствует 85%

замещению аминогрупп в исходном полимере.

Пример 3, Поли-Ь-лизин-Ьглутамат с мол.м. - (tin 1:1 при m 0) сукцинилировали при том же соотношении аминогрупп и янтарного ангидрида, как в примере I. Получен сополимер с Т:т 1:4-9, « (+m):n 1:1 смол.м. 4 8-10 ,

55 Содержание азота (элементный ана лиз), %: 9,01;.9,00. Этосоответствует 86,2% замещению аминогрупп лизина в сополимере. S Пример 4. -Получение комплексов полипептидов. К 0,10 мл .1%-ного раствора поли-Ь-лизина (компонент В, k -15-50 при р О, X К) с мол.м. У. 6г10 в фрсфатсодержащем физиологическом растворе с рН 6,8 (0,1 мол,фосфатный буфер) добавили 0,1 мл 1%-ного раствора сукцината полилизина (компонент А, Г:т 1:4-19 при п О, 1 + т ... х) в буферном растворе при 26°lll и вьщерживали 5мин. Полу ченную смесь наносили на колонку (52 X 1,5 см), заполненную сефадек сом G 150, и элюировали тем же буферным раствором. Колонка предварительно была про калибрована по следующим белкам: инсулин (мол.м. 6x10 ); лизоцим (мол.м. 14x10 ); гемоглобин (мол.м 67x10); альдолаза (мол.м. 147x10 При проведении гельхроматографии сначала выходил пик, содержащий це левой комплекс с объемом задержки 26,5 мл. Второй пик с объемом задержки 27,2 мл соответствует полиL-лизин. сукцинату, третий - с объ емом задержки 28,7 мл содержит пол L-лизин. Мол.м. комплекса 1 ,410 4 10. , интервал стабильности комплекса 3,5-7,5. Пример 5, В условиях прим ра 4 получали комплекс поли-Ь-лизина (компонент В, k 15-50 при р 0,k х) с мол.м. 1,911O и поли-Ь-лизин-сукцината (компонент А, Г:т 1:4-19 0, I + m X, с мол.м. 3, , 85% замещенных аминогрупп). Получен комплекс с мол.м. 1,410 , стабильный при рН 3,5-7,5. Пример 6. КО,1 мл 1%-ного (раствора поли-Ь-лизин-Ь-глутамата с мол.м. от 3x10 до бхЮ, в боратном буфере с рН 7,2 (компонент В, k:p 1:1 при k + р х) в фосфатсодержащем 0,1 мол.буферном растворе с рН 7,2 при добавили 0,10 мл 1%-ноГо раствора в том же буфере поли-Ь-лизин-Ь-глутамат-сукцината с мол.м. 410- 810, 86,2% замещенных аминогрупп, (компонент А, I:m:n 1-9:4:1.при f + m):n 1:1, 1 +Tii + n x). Реакционную смесь выдерживали 10 мин и переноси ли на колонку для гельхроматографии (52x1,5 см), заполненную сефадексом G 150. Целевой комплекс имеет 856 объем задержки 26,9 мл, поли-Ь-лизин-Ъ-глутамат-сукцинат характеризуется объемом задержки, равным 29,3 мл, а поли-Ъ-лизин-глутамат 30,2 мл. Комплекс стабилен в области рН 3,5-7,5. Определенная мол.м. комплекса не является просто арифметической суммой молекулярных, масс его компонентов. Более низкое значение мол.м. свидетельствует об изменении пространственной структуры и заряда, так как метод гельхроматографии позволяет непосредственно оценивать размер макромолекулы. I .. Пример 7 (сравнительный). К 5 мл отмытых бараньих эритроцитов добавили 25 мл 5%-ного раствора формальдегида в фосфатном буфере с рН 7,4. Смесь вьщерживали 20 ч в холодильнике, затем обработанные таким образом зритроциты отделяли фильтрованием и обрабатывали 10 мл холодного 40%-ного раствора формальдегида в течение 24 ч. Затем эритроциты отфильтровывали, отмьшали избытком физиологического, раствора и хранили в том же растворе при рН 7,2. 4 мл 20%-ной суспензии формалинизированных эритроцитов барана в фосфатсодержащем физиологическом растворе (0,009 моль фосфата и 0,10 моль NaCl, рН 7,4) разливали по 1 мл в 4 пробирки. При с перемешиванием медленно добавляли в каяздую пробирку по 9 мл раствора поли-Ь-лизина с мол.м. 7-10 - 610 ,. m О, п О с концентрацией 0,5; 1,0; 2,0 мг/мл в том же фосфатсодержащем физиологическом растворе. К полученным реакционным смесям при с перемещиванием прикапывали по 0,02 мл 12,5%-ного водного раствора глутарового диальдегида Смеси перемешивали 2 ч при , затем выдерживали без перемешивания при -4С в течение 12ч. Осадок в каждой пробирке отмьюали 5 раз физиологическим раствором с центрифугированием и использовали в реакции нейтраминидазы с гемагглютинином (РИГА) в виде 1%-ной суспензии в 1%-ной кроличьей сьшоротке, 1%-ном растворе альбумина человека, 1%-ном полиглюкине (все в физиологическом растворе, содержащем фосфатный буфер с рН 7,2). Данные по реакции РИГА приведены в таблице. Пример 8. В условиях примера 7 готовили диагностикум, где в качестве антигенной детерминанты был взят поли-Ь-лизин-сукцинат (получен впримере 1). Данные по РИГА пр гееде ны в таблице. Пример 9,В условиях примера 7 готовили диагностикум, в котором в качестве антигенной детерминан ты брали поли-Ь-лизин-Ь-глутамат (получен по примеру 3)с мол.м. 3 610..Данные по РИГА приведены в табл. Пример 10.В условиях приме ра 7 готовили диагностикум, в котором в качестве антигенной детерминанты был взят поли-Ь-лизин-Ь-глутамат сукцинат с мол.м. 4 «10 (получен по примеру 3). Данные РИГА приведены в таблице. 1 58 Пример .11 (сравнительный; В условиях примера 7 готовили диагностикум, в котором в качестве антигенной детерминанты был взят полиЬ-лизин с мол.м. 1,9110 (т. О, п 0). Данные по РИГА приведены в таблице. Пример 12. В условиях примера 11 получили эритрюцитарный диагностикум, содержащий в качестве антигенной детерминанты поли-Ьлизин сукцинат с мол.м. 3,2«10 , полученный йо примеру 2. Данные по РИГА приведены в таблице. Пример 13 (сравнительный). В условиях примера 7 получили эритроцитарный диагностикум, применяя в качестве антигенной детерминанты бычий сьшороточный альбумин. Данные по РИГА приведены в таблице.

ч

f

i 1 p.

g g

(. Ь

la

.

о

о рГ

о

«

X

сч

ft

м о

a

о

л

ь.

41

о

2 -с{

л N I-i

и

&

в

и

I

n

|S

«

«о

л

S w

ь

о

о . о

52

W18

I .1

X S

U . в U

л- M Йa

оШОифОЩ

-о fe I «eg.

t X о cf X

9 о H я 8

inСЧ a ii Й к

жM

. оо Й. v я

& i

t

h

II I

пои с. о о

а 9

ss§

тт