Способ получения фермента днк-цитозин-метилазы 1 из клеток Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ДНК-иИТОЗИНМЕТИЛАЗЫ 1 ИЗ КЛЕТОК ESeHERICHI COUI )00

Изобретение относится к способамполучения ферментов из микроорганизмов а именно к способам получения гомогенных ДНК-метилаз. Наиболее близким по технической сунь ности к заявленному является способ получения фермента ДНК-цитозин-метилазы 1 из клеток Esc er-ichia Coti предусматривающий дезинтеграцию биомас сы, центрифугирование при 165000, осаждение из полученного бесклеточного экстракта нуклеиновых кислот, фракционирование белкового раствора сульфатом аммония, обессоливание фракций, содержащих фермент, для чего их соб1фают центрифугированием, растворяют в минимальном объеме буфера, диализуют и хро матографируют на колонках с ДЕАЕ-сефа дексом А -50 и фосфоиеллюлозой f. . К полученному раствору добавляют равный объем глицерина и хранят при температуре - 20 С. Описанный метод не позволяет получить ферментный препарат ДНК-метилазы с достаточной степенью чистоты; конечный продукт содержит 85% примесей. Кроме того, при очистке в 190 раз выход не более 8% (от общей активности). Целью изобретения является получение гомогенного препарата и увеличения выхода фермента. Цель достигается тем, что перед стабилизацией белковый раствор хроматографируют и рехроматографируют на ДНК-агарозе, затем хроматографируют на КМ-целлюлозе и полученный раствор пропускают через последовательно соединенные колонки с ДЕАЕделлюлозой и фосфоцеллюлозой рП, при этом центрифугирование гомогената, осуществляют при 10000-3000 , осаждение нуклеиновых кислот проводят протаминсульфатом, обессоливание фракций ведут гельфильтраиией на сефадексеО-25, а стабилизацию ферментного препарата осуществляют диализом против раствора глицерина. Осаждение нуклеиновых кислот осу373

шествляют 0,5-0,6%-ным раствором прота м инсул 1эфата.

Хроматографию иа ДНК-агарозе ведут в линейном градиенте хлористого натрия от 0,1 до 0,6 М.

Рехроматографию на ДНК-агарозе веnvT в линейном градиенте хлористого наГрия от 0,1 до 0,3 М.

Хроматографию на КМ - целлюлозе ведут в линейном градиенте хлористого натрия от О до 0,1 М.

Диализ ведут в течение суток против 2-х кратного объема 60% раствора глицерина в ФЕМ-буфере,

Сущность способа состоит в том, что клетки Е. COliMIxE 600, выращенные до конца логарифмической стадии роста дезинтегрируют в буфере. Полученный гомогенат центрифугируют при 1000030000 После центрифугирования в бесклеточный Экстракт добавляют протаминсульфат для осаждения нуклеиновых кислот и сопутствуюодах метилаз. Полученный супернатант фракционируют сульфатом aMMOffflH, Осадок, растворенный в буфере, обессоливают на колонках с сефадексом С-25. В обессоленный раствор добавляют хлористый натрий и Фоакционируют на колонке с ДЕАЕ-сефадексо фракишо с ДНК- метилазной активностью концентрируют высаливанием сульфатом аммония. Осадок растворяют в буфере и помешают на колонку с ДНК - агарозой. Фракции с ДНК - цитрзин - метилазой 1 объединяют, Концентрируют ульграфильтрацией, разводят буфером, рехроматографируют на ДНК - агарозе.

В отличие Р -11 фофоиеллюлозы, которая применялась ранее на этом этапе, ДНК-агароза является более мягким ионообменником I и обладает высокой удельной емкостью с повышенным сродством к ферменту. Процесс приготовления ДНК-агарозы не трудоемки и. При хроматографии фермента на ДНК-агарозе результаты хорошо воспроизводимы, фермент меньше инакттнвируется. Таким образом, применение ДНК-агарозы на этом этапе позволяет получить фермент с высокой степенью очистки и большим выходом. Выход фермента на этой стадия составляет 57%.

Собранную активную фракцию далее крнцентрируют Ha NMliat.nian Р-11 фосфоцеллюлозе, хроматографируют на КМиеплЮлозе. Фракции, обладающие активностью, объеданяют и наносят на последоват ьно соединенные кш:онк:и с ДЕАЕ434

целлюлозой и фосфоцеллюлозой. ДНК-ш тозин-метилазу 1 -элюируют в фрсфоаеллюлозной колонке с буфером. Затем раст- . .вор диализуют против глицерина,

,Пример. 5 кг биомассы Escbericli-ia Gobi MRE 600 разрушают при тем. пературе +4°С на прессе A,anton Goutih ,

Разрущенные клетаи суспендируют в 15 л

0,02 М трнс-НС t буфера рН 7,4, содер0 жащего 5%-ныйглицерини 7 мм меркаптоэтанол (ТМ-буфер). Все последующие стадии проводят при температуре . Неразрушенные клетки и дебрис удаляют центрифугированием при ЮОООа в те5 чение ЗР мин. Надосадочную жидкость используют для выделения фермента.

К 16 литрам бесклеточного экстракта в течение полутора часов при перемешивании добавляют порциями 5 литров

0 2,0% протаминсульфата. Осадок удаляют центрифугированием при 10000(J- в течение 30 мин.,

К 19 пиарам надосадочной жидкости добавляют сухой(NH4)2SO4 до 40% оа

5 полного насыщения. Осадок удаляют центрифугированием. К полученному супернатанту добавляют сухой ( ЫНд), 60% от полного насыщения. Осадок собирают центрифугированием и растворяют в

0 1000 мл ТМ буфера; Раствор делят на две разных части и наносят на колонки (5x70 см) с сефаяексом Q-25, уравновешенном ТМ буфером. Объем обессоленного раствора доводят до 4 л и добавля5 ют сухой NaCl до 0,15 М (ЦН4 5О-ФракЦИЯ.

Эту фракцию наносят на колонку (10х 100 см) с ДЕАБ-сефадексом А-50 со скоростью 400 мл/ч. После того, когда выйдет {)аствор свободного объема коло№ки (около 3 литров), собирают еше 1,5 литра опалесцирующего раствора и от брасывают. ДНК-метилазную активность

5 собирают в следующих 5 литрах элюирующего раствора.

Элюат концентрируют высаливанием белков сульфатом аммония до 70% от полного насыщения. Осадок собирают центриjj фугированием, растворяют в 600 мл ФЕМ-буфера (20 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,0; 1мМ ЭДТА; 7 мМ 2-меркаптоэтанол;-5% гл-ицерин), диализируют против 5 литров фЕМ-буфера с четырех5 кратной сменой в течение суток (Фракгшя 2).

Хроматография на ДНК-агарозе. Раствор белка после диализа наносят на колонку (5x30 см ) с ДНК-агарозой, урав5повешенной ФЕМ-буфером со скростью 60 мл/ч и промывают ФЕМ-буфером, содержащим 0,1 ММаСедо тех пор, пока опт1гческая плотность элюата не упадет до нуля. Хроматографию ведут 6 л ФЕМбуфера с линейно повышающейся,концентрацией Nace от 0,1 до 0,6 М со скоро стью 60 мл/ч. Фракции собирают по 20 фермент элюируют со средней концентрацией NaC&0,25 М в объеме 600 мл. фр ции с активностью ДНК-цитозин-метилаз 1 объединяют и концентрируют ультрафил рацией в системе Амикон через мембран РМ-1О до 80 мл и разводят буфером в 2,5 раза до 200 мл (Фракция 3). 200 мл фракции 3 наносят на колонку (5x5 см) с ДНК-агарозой, уравновешенной ФЕМ-буфером, содержащим 0,1 MNa промывают 120 мл этого же буфера и ведут хроматографию 3 л ФЕМ-буфера с линейно повышающейся концентрацией МаСе/ от 0,1 до 0,36 М со скоростью 6.0 мл/ч. Фракции собирают по 15 мл. ДНК-цитозин-метилазу 1 элюируют со средней концентрацией NaCt 0,22 М в объеме 45О мл (фракция 4). Фракцию 4 концентрируют на колонке (5x1 см) с /1iOitman Р-11 фосфоцеллюлозой; уравновешенной ФЕМ-буфером. Для этого фракцию делят на 4-5 равных частей и каждую часть перед нанесением на колонку разводят в 2,2 раза ФЕМ-буфером, нанесение со скоростью 200 мл/час, ДНК-метилазу 1 элюируют с колонки ФЕМ-буфером, содержащим 0,35 NaCl со скоростью 40 мл/ч. Весь белко вый пик с ДНК-цитозин-металазой 1 выходит в объеме 60 мл. Этот белок диализуют против 5 литров 0,01 М калий фосфатного буфера рН 7,0 в течение 16ч с двукратной сменой, далее раствор белк наносят на колонку (2,6x10 см) с КМцеялюлозой, уравновешенную диализным буфером, со скоростью 20 мл/ч. Колонку промывают 120 мл этого же буфера со скоростью 30 мл/ч. Хроматографию веду 750 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера с линейно повьшающейся концентрациейNaCl от О до 0,1 М со скоростью 30 мл/ч. Фракции собирают по 15 мл Активностью ДНК-цитозин-метилазы 1 обладают фракции со средней концентрацией NaClj-равной 0,05 М в объеме 25О мл (фракция 5). Фракцию 5 наносят на две последовательно соединенные колонки (5x1 см) с ДЕАЕ-целлюлозой и фосфоцеллюпозой со скоростью 120 мл/ч. Колонки про- 43 мывают ,ФЕМ-буфером, содержащим 0,05 М NaCljH колонки разъединяют. ДНК-метилазу I элюируют с фосфоцеллюлозы ФЕМ-буфером, содержащим 0,35 М NaCl со скоростью 30 мл/ч в объеме 60 мл дополнительно концентрируют диализом против двух объемов 70% глицерина в ФЕМ-буфере в течение суток, фермент хранят при -20°С, Применение предлагаемого метода позволяет получить гомогенный фермент и повысить выход в 3,5 раза по сравнению с ранее предложенным способом. формула изобретения 1. Способ получения фермента ДИКгштозин-метилазы 1 из клеток Escher-ic.io Co2.iMRE 600, предусматривающий дезинтеграцию биомассы, центрифугирование гомогената, осаждение из полученного бесклеточного экстракта нуклеиновых кислот, фракционирование белкового раствора сульфатом аммония, обессоливание фракций, содержащих фермент, с последующей хроматографией на ДЕАБсефадексе и стабилизацией готового продукта, отличающийся тем, что, с целью получения гомогенного препарата и увеличения вьохода фермента, перед стабилизацией белковый раствор хроматографируют и рехроматографируют на ДНК-агарозе, затем хроматографируют на КМ-целлюлозе иполученный раствор пропускают через последовательно соединенные, колонки с ДЕА Е-целлюлозой и фосфоцеллюлозой Р при этом центрифугирование гомогеНата осуществляют при 10000-30000 осаждение нуклеиновых кислот проводят протаминсульфатом, обессоливание фракцией ведут гельфильтрацией на сефадексе(5-25 а стабилизацию ферментного препарата осуществляют диализом против раствора глицерина. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что осаждение нуклеиновых кислот осуществляется 0,5-0,6%-ным раствором протаминсульфата. 3.Способ по п, 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что хроматографию на ДНК-агарозе ведут в линейном градиенте хлористого натрия от 0,1 до 0,6 М. 4.Способ по п. 1, о т л и. ч а ю щ и-й с я -тем, что рехроматографию на ДНК-агарозе ведут в линейном гра7 7374438

Ёйенте хлористого натрий от ОД дочение суток против 2-х кратного объема

М.60% раствора глицерина в ФЕМ-буфере.

щ и и с я тем, что хроматографию напринятые во внимание при экспертизе

КМ-целлюпозе ведут в линейном градиен-.. Бурьянов Я. И. Нестеренко В. Ф.,

те хлористого натрия от О до 0,1 М.Вагабова Л. М. Докладц Академии Наук

6.Способ по п. 1, о т л и ч а ю -СССР. т. 227, № 6, 1976, с. 1972-ц и И с я тем, что диализ ведут в те-1975.