Способ йодирования клеток Советский патент 1984 года по МПК C07C103/52 

(Л

С

СПОСОБ ЙСдаРОВАНИЯ ЮТЕТОК путем инкубации их в присутствии радиойода и клорамина Т, отличающийся тем, что, с целью повьппения выхода жизнеспособных лимфоидных клеток, инкубацию клеток в концентрации

00

4; 1С N9 Изобретение относится к прикладной иммунологии, преимущественно к получению меченых йодированных клеток, и может быть использовано при проведении иммунологических исследований. Известен способ йодирования белковых структур клеточной стенки посредством хлораминового йодирования белков С13, Однако этот способ не позволяет получить мечеиые лимфоидные клетки с высокой степенью жизнеспособности (выход жизнеспособных клеток 25%). Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных лимфоид ных клеток. Указанная цель достигается тем, что согласно способу йодирования клеток путем инкубации клеток в при сутствии радиойода и хлорамина Т, отличительной особенностью является то, что проводят инкубацию клеток в концентрации (&, 5-3,0)хКГКл/мл с радиойодом в соотношении (2-6)х х10 Кл/мКи, а с хлорамином Т в соотношении (0,25-1,70)х10 Кл/мкг при концентрации хлорамина Т менее 200 мкг/мп. Способ выполняется следуюпщм образом. Мечение выполняют при реакционном соотношении концентраций клеток.к хлорамину Т, равном (0, х10 Кл/мкг, и при реакционном соотношении концентраций клеток к радиойоду, равном (2-6)х10бКл/мКи причем при соблюдении указанных соо ношений реакционная концентрация кл ток должна находиться в диапазоне (0,5-3)х10 Кл/мл, а реакционная кои центрация хлорамина Т не должна пре вышать 200 МКГ/М.П. При этом насыщение лимфоцитов атомами йода подчиня ется формуле ,27+1,24У при ,97 и . ,01, (1 ) где X - радионасьш1енность лимфоцит выраженная в единицах (миллионы ат мов йода/клетка, У - соотношение количество йод 125 в мкюри в реакционной смеси/кол чество клеток, выраженное в сотнях мшшионов/мп реакционной смеси. Формула (1) позволяет заранее рассчитать радионасьш1енность лимфо тов в результате реакций. Известно что чрезмерное радионасьш1ение веде к деградации меченого соединения. 22 т.е. к уменьшению жизнеспособности пройодированных лимфоцитов. С целью получения радиойодированных лимфоцитов с предельно высокими показателями жизнеспособности (падение жизнеспособности в результате реакции менее 3%) для использования в реакциях клеточного иммунитета ин-виво и ин-витро применяют реакционное соотношение концентраций клеток к радиойоду. равное 4x10 Кл/мКн, и соотношение концентраций клеток к хлорамину Т, равное Кл/мкг. Для достижения максимальной чувствительности в исследованиях с при менением полученных меченых лимфоцитов ин-вино и ин-витро путем предельно высоко эффективного йодирования и высокого насыщения клеток йодом (при условии падения жизнеспособности клеток в результате реакции не более чемна 10%) необходимо использовать иммунологически активированные лимфоциты при отношении их концентрации к концентрации клеток, к концентрации хлорамина Т равном 0,56x1 О Кл/мкг. Пример 1. Йодирование лимфоцитов с максимальным сохранением их жизнеспособности. В реакционную пробирку последовательно вносят 0,3 МП клеточной суспензии лимфоцитов в растворе Хенк- са с реакционной концентрацией 1,9х10 Кл/мп, 0,01 мл радиойода 125 (1/2 мКи), 0,1 МП хлорамина Т с реакционной концентрацией 116 мкг/мл. Инкубацию вьтолняют в течение 30 с при умеренном встряхивании. реакцию останавливают добавлением 5 мл холодного раствора Хенкса и отмывают их 3 раза тем же раствором от непрореагировавшего радйойода центрифугированием клеток в течение 10 мин при 800 об/мин (120°). Эффективность йодирования при этом не более 20%, а. жизнеспособность клеток снижается не брлее чем на 2%. Пример 2. Йодирование клеток с максимальной эффективностью реакции мечения и с максимальным насьш ением радиойодом. Заблаговременно выполняют стандартную активацию лимфоцитов иммунологическим методом. Например, вводят за 2 недели до йодирования подопытным животным (мьш1ам) по 6x10 микробных тел коклюшной вакцины. Этот адьювант и неспецифический модулятор иммунологической реакти ности лимфоцитов приводит к сущест венному увеличению количества белковых рецепторов на поверхности лт фоцита. В день йодирования вьщеляю иммунологически активированные лим циты и готовят клеточную суспензию в растворе Хенкса. В реакционную пробирку последов тельно вносят 0,3 мп клеточной суспензии лимфоцитов в растворе Хенкса с концентрацией 1,12х10 Кл/ 0,01 мл раствора йодистого натрия 1/2 мКи О,t мл раствора хлорамина Т с реакционной концентрацией . 200 мкг/мл. Инкубацию проводят 30 с при умеренном встряхивании и далее останавливают добавлением 5 мл раствора Хенкса . Клетки отмывают от непрореагировавшего радиойода 3 раза раствором Хенкса и центрифугированием в течение 10 мин при 800 об/мин (120). Эфг фективность йодирования для активи 1)ованных лимфоцитов в этих условия составляет 50-65%, а неактивирован ньк лимфоцитов 40-50%. Жизнеспособ ность пройодированных клеток более 90%. В табл.1 представлены данные по влиянию времени инкубации лймфр цитов с хлорамином Т на их жизйеспособность, выраженную в единицах число живых клеток «. -. -S::л Л В ТабЛ . / общее число клетокДанные по влиянию времени инкубадаи и концентрации лимфоидных клеток на Их жизнеспособность Примечание: Жизнеспособность лимфоидных клеток в начале инкубацш1.принимают за 100%. в процессе инкубации с хлорамином Т;в табл.3 - эффективность йодирования лимфоидных клеток хлораминовым методом и их жизнеспособность по окончании реакции. Жизнеспособность лимфо1штов падает при инкубации с возрастающими концентрациями хлорамина Т(табл.1). Динамика утраты жизнеспособности клетками становится круче при увеличении концентрации клеток до Зх10®Кл/мп при стандартной концентрации хлорамина Т (табл.2). Полученные данные впервые доказьгеают, что хлораминовое йодирование позволяет при точно определенных условиях получить жизнеспособные лимфоциты, меченые йодом с высокой эффективностью. Жизнеспособность лимфоцитов оценивают во всех случаях общепринятым способом по исключению красителя. Исходя из результатов исследований вьтолнена математическая оптимизация хлораминового йодирования лимфоцитов путем линейной аппроксимации при следующих ограничениях: все зависимости П1 едставлены плоскостью, а не криволинейной поверхностью-, условия экстремума определяют только в области, ограниченной исследованными значениями реакционных концентраций лимфоцитов, хлорамина Т, радиойода и времени реакции. Таким образом, способ позволяет повысить выход жизнеспособных меченых лимфоидных клеток более чем в 3 раза при повышении эффективности йодирования клеток более. чем в 2 раза. Т а б л и ц а 1 Примечани

- Т a б л и ц a. 2 е: Жизнеспособность лимфоидных клеток в начале инкубации принимали за 100%; каждое цифровое значение представлено средним из трех экспериментов. «.ТаблицаЗ

Эффективность,Х6,55

Жизнеспособность,%85

Эффективность,%7,5

Жиэнеспосо|бность,%84

Эффективность,%29,95

Жизнеспособность,%83

Эффективность, 5

Жизнеспособность,%уЗ 33

Эффективность, % -j

Жизнеспособность,%ус с

Эффективность,%At Жизнеспособность,% П ри м е чан и

1084272

.8 Продолжение табл. 3

10 80

0,5

2x10 100

2,8x10 150

0,5

АкЮ 200

-1,12x10 200

0,5

1,9x10 200 е: Жизнеспособность лимфоидных клеток в начале йодирования принимали за 100%, каждое цифровое значение представлено средним значением из трех экспериментов..