Питательная среда для выращивания бактерий FRaNcISeLLa тULаRеNSIS Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к получению питательных сред.

Цель изобретения повышение ростовых свойств.

Пример 1. Питательную среду готовят поэтапно следующим образом.

Приготовление комплекса гемина с ис- тидином.

24 мг гемина добавляют к 20 мл 0 2 М раствора солянокислого гистидина (0.8 г) в дистиллированной воде (рН 8.0). Суспензию оставляют в темноте на магнитной мешалке при 21°С на 15 ч. после чего стерилизуют фильтрацией через нитроцеллюлозные фильтры диаметром пор 0.22 мкм.

Приготовление растворов компонентов питательной среды вносимых в основной раствор отдельно.

Раствор дрожжевого экстракта.

К 15 г дрожжевого экстракта осторожно добавляют 70 мл дистиллированной воды и добиваются полного растворения при го-, стоянном перемешивании, после чего доводят объем до 100 мл дистиллированной водой.

Раствор глюкозы.

К 100 мл теплой дистиллированной воды присыпают 50 г глюкозы и перемешивают до полного растворения.

Приготовление основных растворов для получения плотной синтетической питательной среды.

Приготовление K-Na-фосфатного буфера.

На 1 л берут 1.5 г двузамещенного фосфорнокислого натрия (ЫазНРСм) и 2.6 г од- нозамещенного фосфорнокислого капия (). растворяют отдельно в 300 мл ди

О СО

о

00

со

стиллированной воды и, нагревая растворы до 70°С, добиваются полного растворения солей, после чего растворы сливают, охлаждают до комнатной температуры, доводят рН до 7,2-7,3 и добавляют дистиллированную воду до 1 л.

Для получения плотной синтетической среды разделяют K-Na-фосфатный буфер на две части по 500 мл и к одной из них добавляют 10 г агар-агара (раствор А).

Оставшуюся часть K-Na-фосфатного буфера используют для растворения аминокислот и солей, получая раствор Б. Готовят следующие навески, г: 1 -аргинин-НС10,15 L-гистидин-НС 1.8 L-цистеин-НС 1,3 L-лизин-НС 0,35 D.L-изолейцин 0,2 D.L-метионин 0,45 D.L-треонин 2,0 L-пролин 0,9 L-лейцин 0,2 L-валин 0,75 L-тирозин 0,15 L-серин 0,1 L-аспарагиновая кислота 0,1 NaCI 4,5 MgSO -7Н20 0,04 Каждую из аминокислот растворяют последовательно в 20 мл буфера, нагревают до 90°С, перемешивая до полного растворения. Для лучшего растворения к растворам лейцина, изолейцина и цистеина добавляют по 1 мл 1 М раствора HCI, а к растворам теронина и тирозина по 1 мл 1 М раствора NaOH.

Навески хлористого натрия и сернокислого магния растворяют вместе в 50 мл К- Na-фосфатного буфера. Полученные растворы аминокислот и солей сливают в одну емкость, доводят объем остатками К- Na-фосфатного буфера до 0.5 л (раствор Б) и стерилизуют в автоклаве с отдельно приготовленными растворами дрожжевого экстракта и глюкозы 20 мин при 110°С и давлении 0,5 атм.

Раствор А расплавляют на кипящей водяной бане (100°С) в течение 20 мин.

После стерилизации и охлаждения к раствору Б асептически добавляют 5 мл комплекса гемина с гистидином; 30 мл 15%-но- го раствора дрожжевого экстракта; 28 мл 50%-ного раствора глюкозы.

В случае необходимости стерильно доводят рН полученной среды до 7,0-7,2, используя 0,1 М растворы HCI или NaOH. Осторожно вливают подогретый до 45°С раствор Б с внесенными добавками в емкость с расплавленным агаром (раствор А) и

разливают полученную плотную среду в чашки Петри по 25-30 мл.

Разлитые чашки со средой, а также комплекс гемина с гистидином, растворы дрож- жевого экстракта и глюкозы можно хранить при 4°С д 60 сут (время испытания).

Хранение растворов А и Б возможно, но в этом случае необходимо внесение свежеприготовленного раствора цистеина в рас- 0 твор Б. Для этих целей исключают HCI-цистеин из состава заренее приготовляемого раствора Б и готовят 10%-ный раствор солянокислого цистеина, стерилизуя его автоклавированием при 110°С и данле- 5 нии 0,5 атм в течение 20 мин. Обычно берут 5 г солянокислого цистеина и растворяют его в 50 мл дистиллированной воды. Из стерильного 10%-ного раствора цистеина вносят асептически в стерильный раствор Б 0 13-17 мл непосредственно перед разлизом среды.

П р и м е р 2. Готовят питательную среду аналогичнсгописанию в примере 1, используя при этом следующие навески компонен- 5 тов. г:

K-Na-фосфатный буфер КН2Р043,1 N32HP04 1.8 Раствор А:

0 Агар-агар15,0 раствор Б

L-аргинин-НС 0,25 L-гистидин-НС 1,2 L-цистеин-НС 1,7 5 L-лизин-НС 0,45 D.L-изолейцин 0,4 D.L-метионин 0,55 D.L-треонин 4,0 L-пролин 1.1 0 L-лейцин 0.4 L-валин 0,85 L-тирозин 0,25 L-серин 0,3 , L-аспарагиновая кислота 0,3 5 NaCI 5,5 MgSO -7Н20 0,05 К проавтоклавированному раствору Б стерильно добавляют 20 мл комплекса гемина с гистидином; 5 мл 15%-ного раствора 0 дрожжевого экстракта; 32 мл 50%-ного раствора глюкозы.

П р и м е р 3. Микробиологические испытания плотной питательной среды, описанной в примерах 1 и 2, проводились с 5 использованием в качестве тест-штаммов Fr.tularensis вакцинного штамма 15/3 (Гай- ского) и вирулентного штамма голарктической разновидности IXfe 503. Контрольными средами сравнения служили среда Майского и соавт., а также среда Кундина на

основе агара Д со щелочным раствором черного альбумина, как одна из наиболее чувствительных питательных сред, известных в настоящее время.

Испытания включают определение: а) чувствительности (способности среды обеспечивать рост микроба из минимальных посевных доз); б) скорости роста (времени появления типичных колоний); в) показателей прорастания (процентное отношение числа сформировавшихся колоний на испытуемой среде к числу таковых на контроле).

Для подготовки испытаний штаммы, хранившиеся в лиофилизированном состоянии, дважды пересевались на среду Мак- Коя и инкубировались при 37°С в течение 48 ч. Взвесь микробных клеток готовят, используя стандарт мутности на 10 ед. ГИСК им. Л.А.Тарасевича, последовательными 10- кратными разведениями до 500 и 50 клеток в 1 мл. Каждую посевную дозу высевают по 0,1 мл на 5 агаровых пластин с вариантами сред примеров 1 и 2. а также с контрольными средами. Инкубируют при 37°С в течение 3 сут.

Результаты исследований приведены в табл. 1 и 2.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в отличие от среды Майского на предложенной среде удалось добиться удовлетво- рительного роста вакцинного и вирулентного штаммов Fr.tularensis, сходного по количественным показателям со средой Кундина. Колонии штамма 15/3 появлялись на разработанной среде уже через 48 ч культи- вирования и достигали максимальных размеров через 72 ч, в то время как колонии штамма 503 появлялись несколько позднее (через 72 ч) и достигали максимальных размеров через 96 ч. Изолированная колония достигает 1,0-2,5 мм в диаметре, по форме округлая, выпуклая, прозрачная с серовато- голубоватым оттенком.

Таким образом, предлагаемая плотная питательная среда может найти широкое применение для подсчета жизнеспособных клеток, при выделении чистых культур, определении питательных потребностей как известных ранее, так и вновь выделяемых штаммов туляремийного микроба. Стабиль-

ность состава и высокая химическая чистота компонентов, используемых для ее приготовления, делает возможным применение этой среды в технологии производства туля- ремийной вакцины.

Формула изобретения Питательная среда для выращивания бактерий Francisella tularensis, содержащая солянокислый L-аргинин, солянокислый L-цистеин, солянокислый L-гистидин, солянокислый L-лизин, D.L-изолейцин, D.L- метионин, D.L-треонин, L-пролин, L-лейцин. L-валин. L-тирозин, L-серин, L-аспарагино- вую кислоту, калий фосфорнокислый одно- замещенный, натрий фосфорнокислый двухзамещенный, натрий хлористый, магний сернокислый семиводный, глюкозу, агар-агар и дистиллированную воду, отличающая ся тем, что, с целью повышения ростовых свойств, она дополнительно содержит комплекс гемина с гистидином и дрожжевой экстракт при следующем количественном соотношении компонентов, г/л: Солянокислый L-аргинин 0,15-0.25 Солянокислый L-гистидин 1,2-1,8 Солянокислый L-цистеин 1,3-1,7 Солянокислый L-лизин 0,35-0.45 D.L-изолейцин0,2-0,4 D.L-метионин 0,45-0,55 D.L-треонин 2,0-4,0 L-пролин 0,9-1,1 L-лейцин 0,2-0,4 L-валин 0,75-0,85 L-тирозин 0,15-0,25 L-серин 0,1-0,3 L-аспарагиновую кислоту 0,1-0,3 Калий фосфорнокислый однозамещенный 2,6-3,1 Натрий фосфорнокислый двухзамещенный 1,5-1,8 Натрий хлористый 4,5-5,5 Магний сернокислый семиводный 0,04-0 05 Глюкоза 14,0-16,0 Дрожжевой экстракт 0,75-3,0 Агар-агар 10,00-15.00 Комплекс гемина с гистидином 5-20 мл Дистиллированная вода До 1 л

Таблица 1

Изобретение относится к микробиологии, а именно к получению питательных сред. Целью изобретения является повышение ростовых свойств. Поставленная цель достигается тем. что в среду, содержащую 1-аргинин-НС1. L-цистеин-НС. L-гистидин- HCI. 1 -лизин-НС1. DL-изолейцин. DL-метио- нин. DL-треонин. L-пролин. .L-лейцин. L-валин. L-тирозин. L-серин. L-аспарагино- вую кислоту, калий фосфорнокислый, одно- замещенный. натрий фосфорнокислый двухзамещенный. сернокислый магний семиводный. глюкозу, агар-агар и воду, дополнительно вводят комплекс гемина с гисти- дином и дрожжевой экстракт. Полученная среда позволяет выращивать единичные, колонии как вакцинных, так и вирулентных штаммов. Стабильность состава и высокая химическая чистота компонентов, используемых для ее приготовления, делает возможным применение этой среды в технологии производства туляремийной вакцины. 2 табл. Ё

Биологические свойства питательных сред для культивирования туляремийного микроба

Таблица 2 Сравнительные данные показателей прорастания и темпов роста питательных сред

Среда Кундина

сил,рост 38 ±7 4 ±0,2

спл.рост 46 ±4 4±0,6