РАВНОМЕРНО МЕЧЕННЫЙ ТРИТИЕМ ТИЛОЗИН Российский патент 2009 года по МПК C07B59/00 C07D407/14 

Изобретение относится к области органической химии и может найти применение в аналитической химии, биоорганической химии, биохимии и прикладной медицине.

Для изучения физиологически активных соединения бывают необходимы их меченые аналоги.

Известно, что замена соединений на их меченые аналоги не приводит к изменению каких-либо свойств исходного соединения (Evans Е.А. - Tritium and its compounds London Butterworths, 1974, p.48) [1].

Известен тилозин формулы

Данное соединение является сильно действующим антибиотиком (J.W.Corcoran et al., J. Antibiot. 30, 1012 (1977)) [2].

Однако его меченный тритием аналог не описан.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является расширение ассортимента меченых аналогов физиологически активных веществ.

Достигается указанный технический результат получением нового меченого физиологически активного соединения - равномерно меченного тритием тилозина.

На чертеже показано распределение радиоактивности и оптического поглощения на длине волны 280 нм при анализе меченого тилозина после первой стадии очистки. Условия анализа: колонка Reprosil pur C18aq, 5 мкм, 4*150 мм, условия элюирования:

Элюент А МеОН-50 мМ NH₄H₂PO₄ pH 2.8, (6:4) Элюент В Метанол Градиент Линейный, от 0 до 25% элюента В за 10 мин   изократический участок 25% элюента В   от 10 до 15 мин, подача элюента 1   мл/мин Время удерживания меченого тилозина 5.52 мин

Ниже приведен пример реализации изобретения

В первую камеру реакционной двукамерной ампулы помещали 10 мкмоля тилозина, 20 мг окиси палладия и 25 мг 5% PdO/BaSO₄, во вторую - 200 мкл абсолютного диоксана и 5 мкл триэтиламина. Вторую камеру замораживали жидким азотом и ампулу вакуумировали до давления 0.1 Па и заполняли газообразным тритием до давления 333 гПа. Затем первую камеру нагревали до 70°С. Окись палладия восстанавливалась, тритиевая вода перемораживалась во вторую камеру Реакционную ампулу вакуумировали до давления 0.1 Па, продолжая нагревать первую ампулу до 70°С, и заполняли аргоном. Затем содержимое второй камеры переливали в первую камеру, которую запаивали. Таким образом реакционная смесь состояла из восстановленного катализатора, 100% тритиевой воды, триэтиламина и раствора тилозина в диоксане. Содержимое ампулы нагревали в течение 20 мин при 150°C. Затем ампулу вскрывали, тритиевую воду, триэтиламин и диоксан отгоняли под вакуумом в специальный приемник, остаток растворяли в 3 мл метанола и катализатор отделяли фильтрованием. Катализатор промывали метанолом (5×1 мл). Лабильный тритий удаляли несколько раз, растворяя полученный меченый тилозин в метаноле (5×2 мл) и упаривая последний.

Первый этап очистки меченого тилозина проводили методом ВЭЖХ (колонка Kromasil 100C 18.8×150 мм, скорость потока 2 мл/мин, система: смесь метанола с аммоний фосфатным буфером, рН 2.8, 6:4, время удерживания 7.2 мин). Анализ меченого тилозина после первой очистки проводили методом ВЭЖХ (радиохимическая чистота - около 70%) (см. чертеж).

На хроматограмме приведены два канала: поглощение элюента на длине волны 215 нм (UV215) и радиоактивность элюента (Rad). Оба канала выражены в относительных единицах (мВ, непосредственно выдаваемых детекторами). На хроматограмму наложен профиль градиента - содержание элюента В (0→25%).

На чертеже показано изменение оптического поглощения и радиоактивности при хроматографии реакционной смеси, образовавшейся после введения тритиевой метки и видно, что тилозин содержит тритиевую метку и хорошо отделяется от изомерных продуктов. Поэтому после повторной очистки получен препарат с радиохимической чистотой 97-99%.

Перед дальнейшей очисткой и после окончательной очистки меченого тилозина элюент обессоливали. Для этого из раствора меченого тилозина в элюенте при пониженном давлении удаляли метанол, затем меченый тилозин адсорбировали на патроне Sep-Pack C₁₈, пропуская его водный раствор, затем патрон промывали 2 мл воды и смывали меченый тилозин 3 мл метанола.

Повторную очистку меченого тилозина проводили методом ВЭЖХ на той же колонке, что и первичную, но в указанных ниже условиях градиента:

Элюент А МеОН-50 мМ NH₄H₂PO₄ рН 2.8, (6:4) Элюент В Метанол Градиент Линейный, от 0 до 100% элюента В за   30 мин, скорость потока 2 мл/мин Время удерживания меченого тилозина 12.5 мин

Для приема и обработки хроматографических данных использовался программно-аппаратный комплекс «МультиХром» (ЗАО «Амперсенд», Россия) на базе IBM PC/AT. Радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике с эффективностью регистрации трития 30% в диоксановом сцинтилляторе.

Общий выход меченого препарата после второй стадии очистки составил 17%, молярная радиоактивность 5-7 Ки/моль. Радиохимическая чистота 97-99%.

Таким образом, получено новое равномерно меченное тритием физиологически активное соединение.

Изобретение относится к новому меченному тритием аналогу физиологически активного соединения - равномерно меченному тритием тилозину формулы

Технический результат - расширение ассортимента меченых аналогов физиологически активных соединений, используемых в органической химии, в биологии и в медицине. Данное соединение является сильнодействующим антибиотиком. 1 ил.

Равномерно меченный тритием тилозин формулы: