Способ определения активности липазы Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине а именно к клинической биохимии. Известен способ определения актив ности липазы, основанный на определе нии в сыворотке крови продуктов гидр лиза субстрата липазы специфическими цветными реакциями С З.Однако способ трудоемок и требует дорогостоящих реактивов. Известен также способ определения активности липазы путем добавления к исследуемой пробе субстрата липазы, инкубации смеси и введения в нее индикатора с последующим определением продуктов гидролиза г убстрата С2 Однако метод недостаточно точен, поскольку результат оценивается титрометрически субъективно и длителен. Кроме того, способ применим только для определения активности липазы в сыворотке крови. Цель изобретения - повышение точности и ускорения определения. Указанная цель достигается тем, .что согласно способу определения активности липазы путем добавления к исследуемой пробе субстрата, инкубации смеси в присутствии индикатора с последующим определением продуктов гидролиза субстрата, при котором к исследуемой пробе одновременно добавляют в качестве субстрата 0,1- 0,2 мл трибутирина и в качестве инди катора феноловый красный в буферном растворе с рН 8,4-8,5, инкубацию реакционной смеси проводят в течение 30-60 мин, а продукты гидролиза субстрата определяют колориметрически. Способ осуществляют следующим образом. Берут в орошенную антикоагулянтом микропипетку цельную капиллярную кровь и вносят в изотонический физио логич.еский раствор, центрифугируют. Инкубируют 0,1 мл центрифугата с буфером (рН 8,4-8,5), подкрашенным феноловым красным и с субстратом трибутирином (0,1-0,2 мл). После пре кращения инкубации колориметрируют на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре против воды. Центрифугат добавляют в контрольную пробу после инкубации. По изменению цвета реакционной ср ды по сравнению с контролем судят о количестве липазы. Пример 1. В центрифуражную пробирку вносят 0,2 мл 0 9%-ного ,хлористого натрия и 0,2 мл капнллярной крови, взятой из пальца в микропипетку, окращенную антикоагулянтом. Смесь центрифугируют. В две пробирки (опытную и контрольную) разливают по 2 мл буфера, подкрашенного индикатором. В каждую из этих пробирок добавляют по 0,2мл трибутирина. В опытную пробу вносят О,1 мл центрифугата, слабый гемолиз супернатанта практически не влияет на результаты анализа. Обе пробирки (опыт и контроль) помещают в водяную баню при на 1 ч. После инкубации пробы охлаждают. В контроль добавляют 0,1 мл центрифугата. Затем и в опыт, и в контроль приливают по 3 мл заранее охлажденной дистиллированной воды. Обе пробы центрифугируют 5 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно отсасывают в кювету и колориметрируют йротив дистиплированной HjO при 536 нм в кюветах толщиной 10 мм. По разнице экстинкций контрольной и опытной проб рассчитывают-количество липазы в образце крови по формуле: ljei.Ee54-2o K-t.i.5a 100,, ЕКЕ где EJJ - экстинкция опыта-, . Ец - экстинкция контроля, 5 - коэффициент пересчета на 1 мл. трибутирина, 0,2 мл трибутирина вводят в пробу 0,2-5 1 мл; 20 - коэффициент пересчета на 1 мл крови (расходуется 0,1 мл центрифугата, содержащего разведенную в 2 раза кровь), поэтому 0,05 мл X X 20 1 мл.. Реактивы 1.Вероналовый буфер рН 8,5: 1,545 г мединала (веронала натрия) растворяют в 500 мл воды, добавляют 9 МП 0,1 н. НС1 и 150 мл 0,01%-ного раствора фенолового красного. ДоВобят рН до 8,5. Объем буфера доливают водой до 1л. (Хранить в холодильнике. Пригоден в течение 1 мес). .Раствор индикатрраг 100 мг фенолового красного растворяют в 5,7 мл 0,06 H.NaOH,После полного растворения объем индикатора доводят водой до 25 мл. Получшот 0,4%-ный раствор. Из него готовят 0,01%-ньй раствор (9 мл 0,4%-ного индикатора доводят до 200 мл HjO).

310910654

Пример 2. Больной А. Актив-поджелудочной железы и при дальнейность липазы в крови, определяемаяшем обследовании у больного обнарупредлагаемым способом, составилажен панкреатит.

с 1 .20 . 100 20 Предлагаемый способ позволяет проЁf 0,5 5водить точное определение активности

Полученные данные свидетельствуютлипазы в цельной капиллярной крови

о нормальной функции поджелудочнойза 1 ч, малотравматичен, ife требует

железы.дорогостоящих реактивов, что необхоПример 3. Больной В. Актив-димо в клинической практике для исность липазы составила 75,5 ед, что jgследования состояния подаселудочной .

свидетельствовало о нарушении функциижелезы.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛКНИЯ АКТИВНОСТИ ЛИПАЗЫ путем добавления к исследуемой пробе субстрата, инкубации смеси в присутствии индикатора с последующим определением продуктов гидролиза субстрата, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности и ускорения определения к исследуемой пробе одновременно добавляют в качестве субстрата О,1 .0,2 мл трибутирина и в качестве индикатора феноловый красный в буферном растворе с рН 8,4-8,5, инкубацию реакционной смеси проводят в течение 30-60 мин, а продукты гидролиза субстрата определяют колориметрически.