Способ определения фосфорорганических нестицидов в воде Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к способам биологического анализа качества воды, а именно к анализу природных и сточных ,вод на содержагдае в них фосфорорганических пестицидов и их биологически активных метаболитов по ацетилхолинэстеразной активности, и может быть использовано также в токсикологических исследованиях для контроля стабильности исследуемых растворов и в скрининге (первичной npoBepjce токсичности)вновь синтезированных химических соединений.

Целью изобретения является повыше- 15 образования окрашенного комплекса,

ние чувствительности и расширение функциональных возможностей за счет . определения метаболитов фосфороорга- ческих пестицидов,

Дпя этого анализируемую пробу воды-или забуферивают 0,1 М фосфатным буфером рН 7,5 и фильтруют (при определении высоких концентраций пестицидов в случае гибели в водоеме рыбы и в лабораторных токсикологических опытах) или подвергают дважды экстрагированию хлороформом (при определении низких концентраций, фоновые уровни загрязнения), затем

появляющегося при взаимодействии субстрата с ферментом Затем инкубируют повторно 10 мин, чтобы фермент провзаимодействовал с субстратом, и

20 добавляют в 1,2,4,5-ю пробирки по 2 капли 0,05%-ного раствора прозери- на для остановки реакции, и определяют активность фермента методом Эллмана,.в основе которого лежит из25 мерение продукта реакции, а.не непрореагировавшей части субстрата, как в методе Хестрина, что и обеспечивает более высокую точность предлагаемого способа. Степень окрашивания хлороформ выпаривают, а экстракт растворов в пробирках 1 и 2 измеряют воряют в 0,1 М фосфатном буфере, Подг относительно пробирки 3, в пробирках готовленную первым или вторым способом пробу для анализа вносят в 3 пробирки по 2,5 мл в каждую, а в 3 другие пробирки вносят такое ike количество 0,1 М фосфатного буфера (контроль) , Затем во все пробирки добавля35

4 и 5 относительно пробирки 6 пробирки на ФЭКе с зеленым светофильтром. Высчитывают среднее значение исследуемых (1-ой и 2-сй пробирок) и конт рольных (4-ой и 5-ой пробирок) проб и по формуле определяют степень угнетения активности фермента

ют по 0,5 мл раствора фермента - наиболее чувствительного к определяемому токсиканту, т,ео ингибируемого более низкой концентрацией (таблица),

В таблице приведена концентрация пестицида (мг/л, снижающая активность фермента на 10-й предел определения фосфорорганических пестицидов в воде энзиматическим способомо

В 3-ю и 6-ю пробирки пробирки сравнения, необходимые для определения степени окрашенности используе- растворов и исключения неферментативного гидролиза субстрата) кроме того вносят 2 капли 0,05%-ного раствора прозерина для ингибирования

фермента. Пробирки встряхивают и поме- gg активности фермента, а пробиты прощают в водяную баню на 30 мин,чтобы центов, а по оси абсцисс - не концентрации токсиканта, а логарифмы концентраций, что позволяет представить зависимость между концентрацияобеспечить оптимальное взаимодействие фермента с токсикантом, и выдерживают там при 30 С, что ближе к

стандартным условиям протекания биохимических реакций. После инкубации в каждую пробирку приливают. 0,5 мл

смеси 0,001 М ДТНБ (5,5-дитио-бис- (2-нитробензойная кислота) и 0,006 М субстрата (при использовании фермента ацетилхолинэстеразы - ацетилтиохолин- йодид или ацетилтиохолинбромид, пропионилхолинэстеразы - пропионилтио- холинйодид или пропионилтиохолинбро- мид, холинэстеразы - бутирилтиохолин- йодид или бутирилтиохолинбромид) в соотношении 1;1„ Смесь добавляют для

появляющегося при взаимодействии субстрата с ферментом Затем инкубируют повторно 10 мин, чтобы фермент провзаимодействовал с субстратом, и

добавляют в 1,2,4,5-ю пробирки по 2 капли 0,05%-ного раствора прозери- на для остановки реакции, и определяют активность фермента методом Эллмана,.в основе которого лежит измерение продукта реакции, а.не непрореагировавшей части субстрата, как в методе Хестрина, что и обеспечивает более высокую точность предлагаемого способа. Степень окрашивания 30 растворов в пробирках 1 и 2 измеряют относительно пробирки 3, в пробирках

35

4 и 5 относительно пробирки 6 пробирки на ФЭКе с зеленым светофильтром. Высчитывают среднее значение исследуемых (1-ой и 2-сй пробирок) и конт рольных (4-ой и 5-ой пробирок) проб и по формуле определяют степень угнетения активности фермента

40 .

А 100 - 5т

100

Е.

где А

5

степень угнетения активности фермента;

экстинкция исследуемой пробы;Ец - экстинкция контрольной

пробы.

Процент угнетения активности ферт мента переводят в пробит по таблице - 0 известным способом. Далее рассчитывают содержание в пробе пестицида по калибровочному графику, В отличие от прототипа на графике по оси орди-. нат откладывают не проценты угнетения

31359741

ми токсиканта н угнетением активности фермента линейной функцией. При расчете.количества пестицида в исследуемой пробе по пробиту процента угне тения активности фермента находят логарифм концентрации пестицида, а по таблицам антилогарифмов - концентрацию пестицида в мкг/л или мг/л исследуемой воды,

Пример, 1л воды, отобранной в канале ирригационной системы на территории совхоза, проводящего обработку садов фозалоном, наливают в емкость, добавляют 25 мл хлороформа, пробу перемешивают 10 мин в руках или 5 мин на магнитной мешалке, затем переносят в делительную воронку. После отстаивания хлороформн ю фракцию сливают в сосуд для выпаривания через воронку с фильтровальной бума™ гой и слоем безводного сернокислого натрия Операцию экстракции повторяют дважды. Экстракт досуха выпаривают на водяной бане при 70°С или в колбе ро- тационного испарителя типа ЭРА-СМ и ., растворяют в 10 мл фосфатного буфера. В три пробирки вносят по 2,5 мл исслеПриведенный пример осуществления способа используется при пр.оведуемой пробы и в три пробирки по

г) гni4iri1 «. .-UVd rl -llvyjJLi- o J - J

2,5 МЛ 0,1 М фосфатного буфера (конт- 30 дении фоновых наблюдений за водой, роль). Во все пробирки добавляют по, д ., присутству0,5 мл раствора холинзстеразы сыво- малые концентрации пестицидов,

ротки крови человека, разведенной ри наличии больших концентраций

пестицидов в воде используется упро0,1 М фосфатным буфером до активности по прибору 0,650, что соответствует 0,92 мкмоль/ч гидролизуемого субстрата или 0,015 Е, за 10 мин инкубации, а в 3-ю и 6-ю пробирки кроме то го по 2 капли 0,05%-ного раствора прозерина. Пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в водяную баню с температурой После инкубации в каждую пробирку вносят 0,5 мл смеси 0,001 М ДТНБ и 0,006 М субстрата . (бутирилтиохолинбромид или бутирил- тиохолинйодид) в соотношении 1:1. Пробирки встряхивают и снова инкубируют в водяной бане при 30°С. После 10-минутной инкубации в пробирки 1,2,4,5 добавляют по 2 капли 0,05%- ного раствора прозерина и затем измеряют степень окрашенности растворов в 1-ой и 2-ой пробирках относительно 3-ей- пробирки и в пробирках 4 и 5 относительно пробирки 6 на ФЭКе с зеленым светофильтром.

Результаты по пробиркам следующие:

10,220

20,236 .

40

45

35 ценный вариант способао

Пример. Берут 100 мл анапи- зируемой воды, забуферивают до рН 7,5, добавляя 1,22 г 0,193 г , , рН контролируют рК-метром или иономером. Пробу фильтруют через воронку с фильтровальной бума- гойо В три пробирки вносят по 2,5 мл подготовленной пробы и в три пробирки по 2,5 мл О, 1 М фосфатного буфера Во все пробирки добавляют по 0,5 мл сыворотки крови синца, разведенной 0,1 М фосфатным буфером 1:20 до активности по прибору 0,650, а в 3-ю и 6-ю пробирки кроме того по две капли 0,05%-ного раствора прозерина Пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в водяную баню с температурой 30°С. После инкубации в каждую пробирку вносят 0,5 мп смеси 0,001 М ДТНБ и 0,006 М субстрата бутирилтио холинбромид или бутирилтиохолинйодид в соотношении 1:1. Пробирки встряхи- - вают и снова инкубир пот в водяной ба

50

55

4

40,647

50,653 Складывают результаты измерений

пробирок 1 и 2, пробирок 4 и 5, высчитывают среднее значение и по ле определяют степень угнетения активности фермента в %

100 - -Е on

100

где Е

оп

экстинкция исследуемой пробы (О,220+0,236),228; Ец - экстинкция контрольной

пробы (О,647+0,653),650 А - степень угнетения активности фермента равна 65% . Процент угнетения активности мейта переводят в пробит - 65% соответствует .пробит 5,39 По предварительно построенному калибровочному графику, используя пробит угнетегшя активности фермента,находят логарифм концентрации фозалона, равный 2,4, а по таблицам антилогарифмов - концентрацию пестицида в анализируемой воде, которая составляет 0,004 мг/л

Приведенный пример осуществления способа используется при пр. .-UVd rl -llvyjJLi- o J - J

дении фоновых наблюдений за водой, , д ., присутству

ценный вариант способао

Пример. Берут 100 мл анапи- зируемой воды, забуферивают до рН 7,5, добавляя 1,22 г 0,193 г , , рН контролируют рК-метром или иономером. Пробу фильтруют через воронку с фильтровальной бума- гойо В три пробирки вносят по 2,5 мл подготовленной пробы и в три пробирки по 2,5 мл О, 1 М фосфатного буфера. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл сыворотки крови синца, разведенной 0,1 М фосфатным буфером 1:20 до активности по прибору 0,650, а в 3-ю и 6-ю пробирки кроме того по две капли 0,05%-ного раствора прозерина. Пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в водяную баню с температурой 30°С. После инкубации в каждую пробирку вносят 0,5 мп смеси 0,001 М ДТНБ и 0,006 М субстрата бутирилтиохолинбромид или бутирилтиохолинйодид в соотношении 1:1. Пробирки встряхи- - вают и снова инкубир пот в водяной ба

не при З0 с, После 10 мин инкубации в пробирки 1,2; и 5 добавляют по 2 калии 0,05%-ного раствора прозери- на и затем измеряют степень окрашенности растворов в пробирках 1 и 2 относительно пробирки 3 и в пробирках 4 и 5 относительно пробирки 6 на ФЭКе при зеленом сфетофильтре..

Результаты по пробиркам следующие

10,440

20,456 . 30,620

50,624

Складывают результаты измерений пробирок 1 и 2, и пробирок 4 и 5, высчитывают среднее значение, и по формуле определяют степень угнетения активности фермента в %

А - 1ЛП 2рй. 00 А - 1UU

fi K

где Е

оп

экститодия исследуемой пробы (0,4404-0,456):2 0,448; Е - зкс-шнкцик контрольной пробы (0,6204-0,624) :2 0,622;

А - степень угнетения активности фермента равна 28%, Процент угнетения активности фермента переводят в пробит 28% соответствует пробиту 4j4, По предварительно построекноку калибровочному графшсу, используя пробит угнетег-шя активности фермента, находят лога- рифм концентрации фосфамида равный О 5 а по таблицам антилогарифмов - концентрацию пестицидов в анализируемой воде, которая равна 1 мг/л . При определении метаболитов, например метаболитов хлорофоса, в токсикологическом опыте при изучении поведения водяного ослика в растворах хлорофоса берут в начале опыта 10 мл анализируемой воды, забуферивают до рН 7,5, добавляя 0,122 г и 0,0193 г , рН контролируют рН метром глк иономером. Пробу фильтруют через воронку с фильтровалной бумагой, В три пробирки вносят по 2,5 мя 0,1 М фосфатного буфера. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл сыворотки крови синца, разведенной 0,1 М фосфатным буфером 1:20, до активности по прибору -0,750, а в 3-ю и 6-ю пробирки, кроме того по две капли 0,05%-ного раствора прозерина. Пробирки встряхивают и помещают на

1359741

30 мин в водяную багао с температурой 30 С После 10 мин инкубации в пробирки Ij2,4 и 5 добавляют по 2 капли 0,05%-ного раствора прозерина и затем измеряют степень окрашенности растворов в пробирках 1 и 2 относительно пробирки 3 и в пробирках 4 и 5 относительно пробирки 6,

Результаты по пробиркам следующие

10,725

20,735

40,240

50,252 Складывают результаты измерений

пробирок 1 и 2, и пробирок 4 и 5, высчитывают среднее значение и по формуле определяют степень угнетения активности ферментов в %

А

100

Е.

25

30

где Е. - экстинкция исследуемой . ... пробы (0,725+0,735) : 2 0,730; Е - экстинкция контрольной

пробы (0,240+0,252).: 2 0,246;

А - степень угнетения активности фермента равна 66%, Через 4 ч (согласно схемы токсикологического опыта) опять берут 10 мл анализируемой воды, добавляют 0,122 г доводят рН пробы до 35 7,5 , рН контролируют рН-мет- ром или иономером. Пробу фильтруют через воронку с фильтровальной бума- три пробирки вносят по 2,5 мп подготовленной пробы и в три пробирки 40 -по 2,5 мл 0,1 М фосфатного буфера, Во все пробирки добавляют по 0,5 мл сыворотки крови синца, разведенной 0,1 М фосфатным буфером 1:20 до активности по прибору 0,750, а в третью 45 и шестую пробирки, кроме того по две капли 0,05%-ного раствора прозерина,. Пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в водяную баню с температурой После 10 мин инкубации 50 измеряют степень окрашенности растворов в пробирках 1 и 2 относительно пробирки 3 и в пробирках 4 и 5 относительно пробирки 6.

Результаты по пробиркам следунивде:

1

2 4 5

0,720 0,740 0,060 0.064

-.

713597418

Складывают результаты измерений отбор пробы, введение в нее холинпробирок 1 и 2 и пробирок 4 и 5, высчитывают среднее значение, и по формуле определяют степень угнетения активности фермента в %

зстеразы и субстрата, инкубирование с последующим колориметрированием

с отличающийся тем. что с целью повышения .чувствительности и расширения функциональных возможностей за счет определения метаболи тов фосфорорганических пестицидов, 10 перед введением фермента пробу забу феривают до рН 7,5, в полученный раствор вводят холинэстеразу, после чего полученную смесь инкубируют, в качестве субстрата используют бути100 100

ЕК

где Ед - экстинкция исследуемой

пробы (0,720+0,740): 2 0,730;

Ец - экстинкция контрольной, пробы (0,060+0,064): 2 0,062;

А - степень угнетения активности фермента равна 85%, Увеличение антихолинэстеразной активности раствора хлорофоса с 66 д 85% свидетельствует о повьппении его токсичности за счет превращения хлорофоса в токсичные метаболиты,

Формула изобретения

3,Способ по n,J, о тли ч аю щ и и с я тем, что после забуфери, Способ определения фосфороргани-25 вания из исследуемой пробы удаляют ческих пестицидов в воде, включанзщийобразовавшийся осадок.

Хлорофос

без экстракции

0,045

0,14 0,017

ДДВФ

без экстракции

атафос

без экстракции

арбофос

без экстракции

при экстракции

0,0045 0,012 0,00014

0,01

1,86 0,02

0,02

0,46 0,0025

0,03

0,69 0,006

зстеразы и субстрата, инкубирование с последующим колориметрированием

отличающийся тем. что, с целью повышения .чувствительности и расширения функциональных возможностей за счет определения метаболитов фосфорорганических пестицидов, перед введением фермента пробу забу- феривают до рН 7,5, в полученный раствор вводят холинэстеразу, после чего полученную смесь инкубируют, в качестве субстрата используют бутирилтиохолинбромид или бутирилтиохи- линиодид, который вводят посл.е инкубации пробы с холинэстеразой,

2,Способ попо1, о-тличаю- щ и и с я тем, что перед забуфериванием пестициды экстрагируют хлороформом

3,Способ по n,J, о тли ч аю- щ и и с я тем, что после забуферивания из исследуемой пробы удаляют образовавшийся осадок.

0,00006

0,00000000001

0,000025

0,3

0,002

0,002

0,0000003

0,05

0,025 , 0,0002 .

0,2

0,002

19,05

0,2

0,020,040,05

0,00030,00040,0005

19,0519,050,19

0,20,20,002

0,76 0,0076

Изобретение относится к методам биологического анализа вод Целью изобретения является повьшение чувствительности и расширение функциональных возможностей за счет определения метаболитов фосфорорганических пестицидов Анализируемую пробу воды или забуферивают 0,1-М фосфатным буфером и фильтруют (при высоких концентрациях пестицидов) или токсикант, экстрагируют из воды хлороформом, хлороформ испаряют, экстракт растворяют в 0,1 М фосфатном буфере (при низких концентрациях пестицидов), в подготовленную пробу вносят фермент, наиболее чувствительный к определяемому токсиканту (ацетилхолинэстераза эритроцитов человека, холинэстераза. крови человека, пропионилхолинэстера- за, холинэстераза сыворотки крови синца или плотвы, холинэстераза го- могената дафнии), пробы дважды инкубируют при определяют оста- точную активность фермента и по калибровочным графикам, выражающим зависимость между концентрацией пестицида и угнетением активности фермента линейной функцией, рассчитывают содержание токсиканта в анализируемой пробе. 2 ЗоП. ф-лы, 1 табл. ю W Л