ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI № РПМБ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ ОТ ТОКСИКОЗОВ, ВЫЗВАННЫХ ЭНТЕРОТОКСИНАМИ КИШЕЧНЫХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/108 C12N1/02 C12N15/31 

Изобретение представляет собой новый рекомбинантный штамм РПМБ и препарат на его основе, защищающий организм песцов и лисиц от энтеротоксинов энтеробактерий.

Токсигенные энтеробактерии широко контаминируют кормовые смеси для пушных зверей, часто изолируются из патологического материала животных. Эшерихии, например, продуцируют термолабильный, термостабильный и шигаподобный (веро) энтеротоксины, каждый из которых имеет сероварианты. Посредством генетического обмена они передаются представителям других родов энтеробактерий и даже других семейств бактерий.

Самостоятельно токсины поражают кожу, гениталии, печень, органы пищеварения, выделения, а также активизируют внутриклеточных паразитов, вызывающих вирусные инфекции и паразитарные болезни животных. В результате в зверохозяйствах ежегодно регистрируют спонтанные токсикозы, выражающиеся снижением воспроизводительной функции, поражением кожи, гепатитами, гепатозами, диареей и мочекаменной болезнью. У молодняка регистрируют повышенный отход, отставание в развитии, снижение качества шкурковой продукции. В хозяйствах часто формируются стационарные очаги токсикоза.

Борьба с токсикозами данной этиологии затруднена из-за отсутствия в производстве специфических средств лечения и профилактики. Разработка специфических средств сдерживается антигенной многовариантностью энтеротоксинов разных типов.

Целью изобретения является получение нового штамма, обладающего резидентными антитоксическими свойствами и более широким спектром антитоксической и протективной активности.

Полученный нами штамм бактерий Escherichia coli РПМБ депонирован в коллекции штаммов-возбудителей заболеваний пушных зверей музея бактериальных и вирусных культур Научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства (НИИПЗК) им. В.А.Афанасьева и имеет регистрационный символ РПМБ (резидентный песцовый продуцент микроцина С-51 и В-субъединицы термолабильного энтеротоксина Escherichia coli). Изобретение позволяет повысить продуктивность норок и сократить потери пушных зверей при воспроизводстве в зверохозяйствах.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Характеристика штамма Е.coli РПМБ

Рекомбинантный резидентный песцовый антитоксический препарат обладает пролонгированным действием, синтезируемые им микроцины подавляют энтеробактерии, продуцирующие энтеротоксины, а синтезируемые В-субъединицы экранируют рецепторы для энтеротоксинов и возбуждают специфический иммунитет в кишечнике; резидентные свойства носителя не вызывают отторжения штамма микроэкосистемой кишечника песца, что позволяет применять его реже и в меньших дозах.

Генетические маркеры: встроены гены, детерминирующие биосинтез микроцина С51 и биосинтез В-субъединицы молекулы термолабильного энтеротоксина эшерихий. Морфологические свойства: неспорулирующие и неокапсулированные прямые, размерами 0,6×2 мкм полиморфные палочки, слабоподвижные перитрихи, лежащие изолированно и короткими цепочками. По Граму окрашиваются отрицательно.

Культуральные свойства. Е.coli РПМБ факультативный анаэроб, хорошо размножающийся на мясопептонных питательных средах с рН 7,3 при температуре 37°С. Оптимальным является культивирование микроба в жидкой среде на шейкере при 160 оборотах в минуту на протяжении 18-19 часов. В бульоне возникает равномерное помутнение, образующее муаровые волны при встряхивании, и выпадающий осадок.

На МПА образует небольшие круглые слегка выпуклые колонии с гладкими краями (S - форма). На агаре Эндо образует красные с металическим оттенком колонии.

Антигенные свойства. Гомологичными антисыворотками (в ИФА моноканальными антителами и РДП с поликлональными антителами) выявляются антигенные детерминанты, характерные для В-субъединицы термолабилъного энтеротоксина эшерихий.

Гемагглютинацией эритроцитов морской свинки выявляется адгезивный антиген носителя.

Хранение штамма достигается более года при температуре 2-6°С в лиофильном состоянии на протяжении трех месяцев на скошенном МПА с вазелиновым маслом, на протяжении двух недель в пробирках на скошенном агаре без масла.

Контроль за состоянием штамма осуществляется двояко: раз в шесть месяцев проверяют культуральные, морфологические и биохимические свойства и перед применением в хозяйствах подтверждают специфическую активность путем тестирования микроцинопродукции на минимальной среде Адамса с использованием индикаторной культуры Е. coli В и выявления биосинтеза В-субъединицы термолабильного энтеротоксина эшерихий в иммунохимическом анализе с поликлональными антителами.

Проверку защитной эффективности препарата в реальных производственных условиях проводили в звероплемхозе “Гагаринский” Смоленской области, “Пушное” Тульской области, “Тимоховский” Московской области. Препарат, заданный с кормосмесью в дозе 100 млн м.т., выделялся из кишечника в течение четырех недель, при этом выход щенков на одну основную самку на 0,3 щенка был выше, чем в контроле, а отхода щенков не наблюдали. Повышались также товарные качества шкурки.

В повышенных концентрациях (500-1500 млн м.т.) препарат обладает лечебным эффектом при разовой даче.

Конструирование штамма. С этой целью в генетический аппарат изолированной из кишечника песца Е. coli с адгезивной активностью встроены гены, детерминирующие биосинтез микроцина С51, и рецепторная субъединица термолабильного энтеротоксина эшерихий. Микроцин подавляет рост и развитие широкого спектра энтеробактерий, продуцирующих термолабильный, термостабильный и шигаподобный (веротоксин) энтеротоксины, В-субъединица экранирует рецепторы кишечника для энтеротоксина и инициирует специфический иммунитет в кишечнике, поскольку с нею ассоциированы детерминанты протективного антигена молекулы токсина.

Следовательно, нами сконструирован оригинальный комплексный антитоксический и протективный препарат на резидентном для кишечника песца носителе, применение которого технологично для пушного звероводства.

Имеется несколько близких штаммов Е.соli, и наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к заявляемому штамму является штамм Е.coli М 17 (см. патент РФ №1633817 с 12 №15/30), а также штамм бактерий Е.coli ВКМ СК-322Д (патент РФ №1819428 с 12 №15/30), обладающие антибактериальной активностью.

В этих патентах описана полученная плазмидная ДНК, в которую встроены гены В-субъединицы термолабильного энтеротоксина эшерихий и рекомбинантный штамм Е.coli, несущий плазмиду р74, детерминирующую синтез микроцина С 51.

Однако указанные штаммы не обладают адгезивными свойствами, выделены из организма человека и не способны к длительной персистенции в организме плотоядных.

Для получения нового штамма бактерий Е.coli РПМБ выделили из фекалий клинически здорового песца Штамм бактерий Е.coli, используемый в дальнейшем при конструировании рекомбинантной резидентной бактерии Е.coli (РПМБ) для защиты песцов от энтеротоксинов кишечных бактерий.

Пример 1. Выделение резидентного штамма Е.coli.

Штамм Е.coli был выделен из тонкого отдела кишечника клинически здорового песца. Видовая принадлежность определена на основании результатов АР-теста. Штамм не содержал плазмидной ДНК, не нес детерминант лекарственной устойчивости, но обладал адгезивными свойствами.

Пример 2. Конструирование штамма комплексного антитоксического пробиотика РПМВ.

В качестве резидентного штамма при создании комплексного антитоксического пробиотика использовали апатогенный штамм Echerichia coli с выраженной способностью к адгезии, выделенной из тонкого кишечника клинически здорового песца.

Плазмиды pLTB - несущая ген рецепторной субъединицы В термолабильного токсина эшерихий и р 74 - детерминирующая синтез микроцина С51, были выделены и очищены из клеток донорских штаммов jm 103 и M17 соответственно.

Процедура выделения заключалась в следующем: бактериальные клетки из 10 мл ночной бульонной культуры осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 0,5 мл буфера STET следующего состава: сахароза 8%, тритон Х-100 0,5%, ЭДТА 25 млм, Трис- НСl 25 мМ рН 8,0. После этого к ним добавляли 0,25 мл 0,3 NaOH, помещали на водяную баню при температуре 70°С и инкубировали в течение 15 минут. Затем к образцу добавляли 0,2 мл смеси равных объемов фенола с хлороформом и после энергичного перемешивания центрифугировали при 14 тыс. об в минуту в течение 10 минут. Отбирали водную фазу, к которой последовательно добавляли 0,07 мл ЗМ раствора ацетата натрия и 0,7 мл изопропанола, перемешивали и центрифугировали. Осадок ДНК дважды промывали 70% этанолом, просушивали под вакуумом и растворяли в 0,05 мл бидистилированной воды.

Далее полученные таким образом препараты плазмидных ДНК использовались для введения в резистентный штамм Е.coli. С этой целью применяли метод трансформации с использованием хлористого рубидия. Ночную культуру резидентного штамма разводили в 200 раз средой LB и подращивали до середины логарифмической фазы роста. Отбирали аликвоту объемом 2 мл, бактериальные клетки осаждали центрифугированием и промывали 1 мл трансформационного буфера I, содержащего 10 мМ MOPS, 10 мМ RbCl pH 7,0. Клетки вновь собирали центрифугированием и ресуспендировали в 1 мл трансформационного буфера II следующего состава: 100 мМ MOPS, 50 мМ СаСl₂ и 10 мМ RuCl pH 7,0. После 15-минутной инкубации при 4°С клетки осаждали центрифугированием и вновь ресуспендировали в 0,2 мл буфера II, к которым последовательно добавляли 0,01 мл ДНК плазмиды pLTB и 0,003 мл демитилсульфоксида. После 30-минутной инкубации клетки подвергали температурному шоку (44°С, 45 сек) и высевали на агаризованную среду LB.

Следующим этапом в конструировании штамма комплексного антитолксического пробиотика было введение в резидентный штамм, несущий рекомбинантную плазмиду pLTB второй плазмиды, детерминирующей синтез микроцина С51. Для этого ночную бульонную культуру резидентного штамма разводили в 100 раз средой LB и выращивали до середины логарифмической фазы роста. Клетки в объеме 40 мл осаждали центрифугированием и промывали 0,15 М NaCl, суспендировали в 2 мл 50 мМ раствора CaCl₂. После 20 минут инкубации к ним добавляли 20 мкл лигазной смеси и инкубировали еще 40 минут в ледяной бане. После температурного шока (42°, 3 мин) клетки разводили в 0,5 мл среды LB, инкубировали 1,5 часа при 37°С и высевали на агаризованную среду LB. Чашки Петри с агаризованной средрой помещали на сутки в термостат при температуре 37°С. Выросшие колонии отбирали и проверяли на продукцию рецепторной субъединицы В и микроцина С51.

Пример 3. Изучение продукции и иммунологической активности В-субъединицы.

Для определения иммунологической активности белка был применен метод двойной радиальной диффузии по методу Ухтерлони.

Для этого штамм РПМБ культивировали в 250 мл среды МПБ в течение 24 часов, бактериальные клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 0,01 М Трис-НСl буфера, содержащем 0,15 М NaCl с рН 8,6. Полученную клеточную суспензию подвергали обработке ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе ME 150.

Для постановки реакции использовали 1% агар, приготовленный на вышеуказанном буфере, и поликлональную сыворотку к полноразмерной молекуле LT. Полученный лизат образовывал полосы преципитации с сывороткой в разведении 1:128. Иммуноблот, поставленный с данным лизатом, позволил определить молекулярную массу продуцируемого белка в 12,7 кД, что соответствует молекулярной массе В-субъединицы.

Пример 4. Изучение синтеза антимикробной активности микроцина С51 продуцируемого штаммом РПМБ.

Для оценки продукции и антимикробного действия клетки штамма РПМБ высевались уколом на среду следующего состава (г/л дистилированной воды) Na₄Сl 1 г; КН₂PO₄ 1,5 г; Na₂HPO₄ 3,5 г; MgSO₄ 1 г; агар бактериологический 15 г; глюкоза 0,2%; дрожжевой экстракт 0,3% рН 7,0-7,5. После 2 суток выращивания при 37°С выросшие колонии убивают парами хлороформа, после чего поверхность среды заливали вторым слоем - 3 мл 0,7% агаризованной среды того же состава с 0,1 мл индикаторной культуры штамма Escherichia coli В, выросшей до экспоненциональной фазы роста в жидкой питательной среде того же состава. Через сутки инкубации при 37°С вокруг продуцирующих микроцин колоний образуется зона подавления роста от 20 до 40 мм в диаметре.

Пример 5. Изучение вирулентности и приживаемости штамма РПМБ в организме лабораторных животных и пушных зверей.

С этой целью бульонную культуру испытуемого штамма в дозе 10⁹ вводили лабораторным мышам живой массой 16-20 г перорально и внутрибрюшинно. Ни в одном случае гибели животных не наблюдали. При вскрытии животных паталогических изменений в органах не обнаружено.

При пероральном введении штамма пушным зверям и на модели лабораторных животных была продемонстрирована хорошая приживаемость штамма в кишечнике.

При пероральном введении препарата белым мышам (1 млрд м.т.), кроликам (540 млн м.т.), лисице (100 млн м.т.) и песцам (300 млн м.т.) токсичность не проявлялась.

ПАСПОРТ МИКРООРГАНИЗМА

1.Е.соli РПМВ

2. 6 января 2001 г.

3. Обладает антигенной активностью термолабильного энтеротоксина эшерихий и адгезивными антигенами к эритроцитам морской свинки.

4. Содержит гены микроциногении и биосинтеза В-субъединицы молекулы термолабильного энтеротоксина эшерихий

5. Не патогенна.

6. Для белых мышей, кроликов, норок, песцов, лисиц при пероральном применении не патогенен.

7. На среде Адамса ингибирует индикаторную Е. coli В с зоной 8 мм, стомологичной для LT антисывороткой положительно реагирует в РДП.

8. Носитель выделен из кишечника песца в 1995 г., как антитоксический рекомбинант сконструирован Козловским Ю.Е. в 1999 г.

9. Плазмида р74, ответственная за синтез микроцина CSi, изолирована из рекомбинантной Е. coli M 17, полученной из Института молекулярной генетики РАН в 1993 г.

10. Производственный

11. Лиофилизированный, МПА под вазелиновым маслом, на полужидком агаре.

12. Культивируют в МПБ при 37°С на шейкере при 160 кач/мин 18-20 час.

13. Пересев на МПА каждые два месяца, проверка специфической активности - каждые 6 месяцев.

14. Грамнегативные палочки, красные колонии S-формы на среде Эндо, сбраживают глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, арабинозу, рамнозу, маннит, инозит. Синтезирует бета-галактозу и образует индол, не образует сероводород, не разжижает желатину.

15. 16 августа 2002 г.

16. Гомогенная культура, 10 пробирок с агаром под вазелиновым маслом.

17. Культура штамма чувствительна к канамицину.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм получают путем встраивания в генетический аппарат изолированной из кишечника песца Е.coli с адгезивной активностью генов, детерминирующих биосинтез микроцина С 51 и В-субъединицы термолабильного энтеротоксина эшерихий. Микроцин подавляет рост и развитие энтеробактерий, продуцирующих термолабильный, термостабильный и шигаподобный (веротоксин) энтеротоксины. В-субъединица экранирует рецепторы кишечника для энтеротоксина и инициирует специфический иммунитет в кишечнике, поскольку с ним ассоциированы детерминанты протективного антигена молекулы токсина. Штамм используют для получения препаратов прологированного действия; синтезируемые им микроцины подавляют энтеротоксические энтеробактерии, а синтезируемые В-субъединицы молекулы термолабильного энтеротоксина эшерихий экранируют рецепторы для энтеротоксинов и возбуждают специфический иммунитет в кишечнике; резидентные свойства носителя не вызывают отторжения штамма микроэкосистемой кишечника норки, что позволяет применять препараты на его основе реже и в меньших дозах.

Штамм бактерий Escherichia соli НИИПЗК № РПМБ, предназначенный для защиты пушных зверей от токсикозов, вызванных энтеротоксинами кишечных бактерий.