Способ получения диагностического иммуноглобулина к вирусу Западного Нила Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

СО

Изобретение относится к способу получения диагностических препаратов, содержащих иммуноглобулины и может быть использовано в вирусологической и эпидемиологической практике для выявления и одновременной идентификации вируса Западного Нила и его антигенов прямым иммунолюминесцентным методом.

Известен способ получения диагностического иммуноглобулина к флавивирусам подгруппы денге, включающий приготовление антигена, иммунизацию мышей этим антигеном, выделение иммуноглобулина из асцитной жидкости мышей 1 .

Однако известный способ не дает возможности получить диагностический иммуноглобулин к вирусу Западного Нила, так как видоспецифический антиген вируса Западного Нила содержит небольшое количество остаточного активного вируса, который при иммунизации мышей размножается и выэБгоает в организме интенсивное образование группоспецифических антител, реагирующих с другими флавивирусами.

Целью изобретения является повышен ние видовой специфичности иммуноглобулина к вирусу Западного Нила.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения диагностического иммуноглобулина к вирусу Западного Нила, включающему приготовление видоспецифического антигена вируса Западного Нила, гипериммунизацию мышей этим антигеном, получение иммунной асцитной жидкости и выделение из нее иммуноглобулина, иммуниэацию мышей провидят видоспецифическим антигеном, остаточный вирус в котором инактивируют прогреванием в течение 20-24 ч при Зб-37с.

I

П f) и м е р. Белых мышей - сосунков в возрасте 2-4 дней заражают в мозг вирусом Западного Нила (штамм. Нр-91). Заболевших животных усыпляют эфиром и извлекают их мозг с соблюдением правил асептики. Ткань мозга, содержащую вирус Западного Нила, тщательно гомогенизируют в фосфатном солевом буферном растворе рН 7,2 7,4 (на один мозг берут 0,9 мл этого раствора). К полученной суспензии мозга добавляют двойной объем ацетона, охлажденного до 2-5 С. Смесь перемешивают 50-60 с и центрифугируют 5-7 мин при 2500-27ОО и 2-5°С. Жидкость полностью удаляют, а осадок, ресуспендируют в 0,15 М фосфатном солевом буферном растворе рН 7,2-7,4, взятом в количестве, равном объему исходной суспензии мозга. Взвесь центрифугируют 30-35 мин при 3500 40009 и . Надосадочную жидкость, представляющую собой видоспецифический антиген вируса Западного Нила, отсасывают. Затем для инактивации остаточного ее прогревают 20-24 ч при Зб-37 С.

Беспородным белым мышам массой 20-24 г два раза с интервалом в 6-7 дней внутримышечно (в заднюю лапку) вводят по 200 мкл смеси, состоящей из равных объемов видоспецифического антигена вируса Западного Нила и адъюванта следующего состава, вес. %: вазелиновое масло 90, безводный ланолин 10 и вакцина БЦЖ 500 мг/л.

Через 3 недели после первичной иммунизации проводят реиммунизацию ; животных. При этом мышам вводят внутрибрюшинно через день видоспецифический антиген вируса Западного Нила в количествах 100, 200, 300, 400 и 500 мкл.

Через день после заключительной инъекции антигена мышам внутрибрюшинно вводят 200 мкл суспензии клеток асцит-саркомы TG/180, что приводит к накоплению в брюшной полости животных асцитной жидкости, содержащей иммуноглобулины.

По мере накопления (через 1525 дней после иммунизации) асцитную жидкость собирают путем пункции брюшной -полости животных и с помощью центрифугирования (20-25 мин при 20002500°С) освобождают ее от сгустков фибрина и клеточных элементов.

Иммуноглобулин из асцитной жидкости выделяют осаждением этиловым алкоголем по Кону или хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

Присоединение к иммуноглобулину флуоресцеинизотиоцианата проводят в щелочной среде при рН 8,9-9,0, температуре 2-5°С и постоянном помешивании реагентной смеси в течение 18 ч. Содержание иммуноглобулина в реагентной смеси должно составлять 1-1,2%. Флуоресцеинизотиоцианат берут из расчета 2-2,5 сг на.100 мг иммуноглобулина.

Очистку полученного люминесцирующего иммуноглобулина от свободного несвязавшегося с белком флуоресцеяизотиоцианата осуществляют с помощью диализа против фосфатного буфера рН 7,2-7,4 с последующей хроматографией на колонке с Дауэксом 1x4 или Сефадексом Г-50.

Подлинность получаемого продукта подтверждают его титрованием с антигенами различных флавивирусов (контроль активности и специфичности).

Пример титрования диагностического люминесцирующего иммуноглобулина к вирусу Западного Нила.

Культуры клеток, чувствительные к флавивирусам (например, ВНК-21 или СПЭВ), выращенные на стеклянных пластинках, помещенных в пробирку или флаконы с питательной средой, инфицируют различными флавивирусами. Через 20-24 ч стеклянные пластинки с монослоем клеток отмывают от питательной среды 0,15 М раствором хлорида натрия, высушивают и фиксируют 15-20 мин холодным (2-5°G) ацетоном. Люминесцирующий иммуноглобулин .доводят до содержания белка 1%, добавляя 0,01 М фосфатный солевой буферны раствор рН 7,2-7,4 или концентрируя препарат выпариванием. Далее из люми несцирующего иммуноглобулина готовят серию двукратных разведений на фосфатном солевом буферном растворе (от Ii4 до 1:128). Каждое разведение смешивают с равным количеством альбу мина, меченого родамином (производства ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи}, взятого в рабочем разведении. Таким образом получают конечные разведения люминесцирующего иммуноглобулина от 1:8 до 1:256. Эти конечные разведения наносят тонким слоем на фиксированные препараты клеточных культур, инфицированных флавквирусами, и помещают их на 30 мин во влажную камеру. Затем препараты ополаскивают водой, на 10 мин погружают в фосфатный солевой буферный раствор рН 7,27,4, снрва ополаскивают водой и высушивают при комнатной теютературе. В заключение окрашенные препараты просматривают под лктинесцентным микроскопом, используя водноиммерсионный объектив х70 и окуляр х5. Регистрируют интенсивность свечения вирусных антигенов, локализованных в цитоплазме клеток препаратов, обработанных различными разведениями люминесцирующего иммуноглобулина. Оценка активности и специфичности диагностического люминесцирующего иммуноглобулина к вирусу Западного Нила представлена в табл.1. Из приведенных в табл.1 данных видно, что испытанный образец диагности ческого люминесцирукадего иммуноглобу лина к вирусу Западного Нила имеет красящий титр 1:64 и слабо окрашивает или вообще не окрашивает антигены других флавивирусов. Такой препарат в рабочем разведении 1:32 может быть использован для выявления и одновременно идентификации Западного Нила. Пример использования диагностичес кого люминесцирующего иммуноглобулин к вирусу Западного Нила для одномоментного выявления и идентификации этого возбудителя . Культуры клеток, выращенные на стеклянных пластинках, заражают различными флавивируссши. Через 20-24 ч стеклянные пластинки с клетками отмывают, клетки фиксируют ацетоном. На монослой клеток наносят диагностический Люминесцирующий иммуноглобулин к вирусу Западного Нила, взятый в рабочем разведении (1:32) и содержащий рабочую дозу альбумина, меченого родамином. Через 25-30 мин клетки отмывают, высушивают и просматривают под люминесцетным микроскопом, отмечая препараты со светящимися клетками. . Эксперименты показывают, что клет- ки со светя{1{ейся цитоплазмой имеются в культурах, зараженных вирусом Западного Нила, а в культурах, заражённых вирусс1ми японского энцефалита, энцефалита Сент-Луис, желтой лихорадки, клещевого энцефалита, денге типа 2, незаражённых, подобных клеток нет. Результаты сравнительных испытаний иммуноглобулина к вирусу Западного Нила, полученных предлагаемым и известным способами в различных серологических местах, представлены в табл. 2. Данные, приведенные в табл..2, по-г казывают, что иммуноглобулин, полученный предлагаемым способом, имеет более высокую видовую специфичность по сравнению с иммуноглобулином, приготовленным известным способом. Этот вывод вытекает из сопоставления гомологичных титров (с антигеном вируса Запгудного Ннла) и гетерологичных титров (с антигенами других флавивирусов, наиболее близких в антигеннсда отношении к вирусу Западного Нила). Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить видовую специфичность иммуноглобулина в 8-16 раз и точнее идентифици ровать вирус Западного Нила среди других флавивирусов.

Таблица

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА К ВИРУСУ ЭАПАдаОГО НИЛА, включающий приготовление видоспецифического антигена вируса Западного Нила, гипериммунизацию мышей этим антигене, получение иммунной асцитной жидкости и выделение нэ нее иммуноглобулина, о т л ичающийся тем, что, с целью повьиаения видовой специфичности им муноглобулина, иммунизацию мышей проводят видоспецифическим антигеном, остаточный вирус в котором инактивируют прогреванием в течение 20 24 ч пои 36-37°С.

Японского

1 + .энцефалита 2+

Энцефалита

14Сент-Луис

Йльеус Дёнге типа Желтой лихорадки

Клещевого энцефалита

Т а б л и ц а