ШТАММ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА (TICK-BORNE ENCEPHALITIS) СЕМЕЙСТВА FLAVIVIRIDAE, РОДА FLAVIVIRUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2009 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к вирусологии, точнее к производству вирусных диагностических препаратов.

Известно использование штаммов вируса клещевого энцефалита (КЭ) Софьин, Абсеттаров, Пан, Лз (Васильева О.А. и др. Производственная и эпидемиологическая характеристика противоэнцефалитной мозговой вакцины, выпускаемой ТомНИИВС // Материалы науч. конф. - Томск, 1962. - С.63-65) и 205 (Котыхов И.В., Киселева Н.Н., Федоров Ю.В. Изучение популяции производственного штамма 205 вируса клещевого энцефалита // Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита: Тез. докл. всесоюзн. симп. - Иркутск, 1990. - С.71-72) для приготовления вакцины и диагностических препаратов.

Однако в настоящее время применяемые в производстве вакцин и диагностических препаратов штаммы относятся к дальневосточному или европейскому подтипу вируса КЭ. Третий сибирский подтип вируса КЭ доминирует (более 60% природной популяции) на территории России. В урало-сибирском же регионе, где в основном циркулирует сибирский подтип вируса КЭ, несоответствие между местными природными штаммами и штаммами-продуцентами диагностических, профилактических и лечебных препаратов наиболее выражено. В частности, при использовании коммерческих диагностикумов КЭ для обследования в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции связывания комплемента (РСК) парных сывороток больных КЭ из регионов Урала и Сибири в ряде случаев не удается выявить диагностического нарастания титров антител и тем самым подтвердить диагноз "КЭ", поскольку большинство больных инфицировано сибирским подтипом вируса КЭ. Использование антигенов сибирского подтипа вируса КЭ позволяет выявлять у больных КЭ в РТГА и РСК более высокие титры антител к вирусу КЭ и в более ранние сроки.

Задача изобретения - получение оригинального штамма вируса КЭ сибирского подтипа для получения адекватных диагностических препаратов, используемых в зоне превалирования сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита.

Технический результат. Оптимизация лабораторной диагностики, специфической профилактики и терапии КЭ в урало-сибирском регионе России.

Новым в достижении поставленной задачи является то, что в качестве продуцента диагностических препаратов нами из коллекции вирусов выбран штамм Тенис вируса КЭ, который на основании генотипирования в ПЦР с последующим секвенированием фрагмента гена Е, типирования в РСК по растворимому антигену, РДПА с перекрестно-адсорбированными сыворотками отнесен к сибирскому подтипу (Siberian subtype) вируса КЭ.

Штамм Тенис вируса КЭ хранится в Государственной коллекции вирусов ГУ НИИ им. Д.И.Ивановского РАМН (депонент №821), выделен в 1985 г. на территории Омской области в зоне северной лесостепи в окрестности оз. Тенис из отдельной особи переносчика вируса - таежного клеща (Ixodes persulcatus) на первом пассаже, адаптирован к пассированию в организме белых мышей, прошел 5 пассажей.

Признаки, используемые для характеристики штамма

Адаптационные свойства. Штамм Тенис вируса КЭ высоко патогенен для новорожденных и взрослых белых мышей, вызывает типичную клинику экспериментального энцефалита с летальным исходом. Инкубационный период для новорожденных белых мышей при внутримозговом заражении составляет 5-6 дней при первичном заражении и сокращается до 4-5 дней в последующих пассажах. Инфекционный титр штамма достигает 10 lg LD_{50/0,015 мл}. При подкожном и внутрибрюшинном заражении 6-8 гр. белых мышей линии Balb/c инкубационный период составляет 5-6 дней, максимальный титр 8,0 lg LD_{50/0,25 мл}. При интрацеребральном заражении - 4-5 дней, оптимальный титр 9,0 lg LD_{50/0,03 мл}. Индекс инвазивности Balb/c - 1,0.

По патогенности для человека относится ко II группе вирусов-возбудителей инфекционных болезней человека.

Антигенные свойства. Штамм Тенис вируса КЭ обладает устойчивой гемагглютинирующей (ГА) активностью. Антигены штамма агглютинируют эритроциты гуся в широком диапазоне рН от 5,45 до 6,75 с оптимальным 6,1-6,25. Серии сахарозо-ацетонового антигена, полученные из этого штамма, в том числе, инактивированные бетапропиолактоном, лиофилизированные, и прошедшие контроль на отсутствие инфекционности на беспородных белых мышах имели титр в РГА до 1:5120 (зона устойчивой агглютинации эритроцитов 0-5120), в РСК до 1:1280, растворимые антигены имели титр в РСК до 1:256.

Штамм Тенис вируса КЭ при иммунизации лабораторных животных вызывает образование антигемагглютинирующих, комплементсвязывающих, вируснейтрализующих и преципитирующих антител. Титры иммунных асцитных жидкостей (ИАЖ) к этому штамму в РТГА с гомологичным антигеном достигают 1:2560, в РСК 1:320. У больных людей с остролихорадочными заболеваниями в сыворотках крови выявляются антигемагглютинирующие, комплементсвязывающие, вируснейтрализующие и преципитирующие антитела к штамму Тенис вируса КЭ. В РТГА, РСК с сахарозо-ацетоновами и растворимыми антигенами и РН с набором ИАЖ к вирусам, относящимся к различным группам, штамм Тенис идентифицирован как вирус КЭ.

Генетические признаки. Первичная структура фрагмента генома штамма Тенис вируса КЭ (160 нуклеотидов, участок гена Е) позволяет отнести его к сибирскому подтипу вируса КЭ: в структуре поверхностного гемагглютинина Е в позиции 206 аминокислотной последовательности дислоцирована маркерная аминокислота лейцин, что является отличительным признаком сибирского подтипа вируса КЭ. Устойчивость к действию мочевины (U - признак): при обработке 8 М мочевиной в течение 30 мин при 37°С сахарозо-ацетоновые и боратно-солевые антигены вируса теряют инфекционность и гемагглютинирующую (ГА) активность, при снижении комплементсвязывающей (КС) активности в 2 раза.

Культуральные свойства. Заражение штаммом Тенис вируса КЭ культур клеток СПЭВ и Vero E6 приводит к острой инфекции, сопровождающейся дегенерацией клеток. Титр для клеток СПЭВ равен 10 lg ЦПД_50/мл. В культуре клеток СПЭВ под агаровым покрытием штамм вируса вызывает появление негативных колоний. Бляшки прозрачные с ровными контурами, размером 3,0-3,5 мм, появляются на 3-й день, достигая максимальной четкости на 5-6-й день.

Таким образом, на основании морфологических, инфекционных, генетических и антигенных признаков штамм Тенис вируса КЭ относят к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus, сибирскому подтипу вируса КЭ.

Штамм Тенис вируса КЭ содержит однородную популяцию вирионов, обладает выраженной ГА активностью и используется как продуцент ГА диагностикума для РТГА и КС диагностикума для РСК.

Диагностический препарат - ГА и КС антиген из штамма Тенис вируса КЭ получают путем внутримозгового заражения новорожденных или 6-8-граммовых белых мышей. Из мозга животных, взятого на высоте клинических проявлений заболевания, готовят антиген методом сахарозо-ацетоновой экстракции, который инактивируют бетапропиолактоном (Э.Леннет, Н.Шмидт. Лабораторная диагностика вирусных и реккетсиозных заболеваний, М., 1974. - С.206-211). Диагностическую ИАЖ готовят по методу С.Я.Гайдамович (Гайдамович С.Я, Львова А.И., Обухова В.Р. и др. Вопр. вирусологии, 1969, №6. - С.676-683).

В более чем 50% случаев ГА диагностикумы из штамма Тенис вируса КЭ оказались эффективнее коммерческого диагностикума КЭ производства НПО "Вирион" г.Томска (дальневосточный подтип вируса КЭ) при выявлении в РТГА антител в сыворотках крови больных КЭ и доноров из Западной Сибири. Так, при исследовании 120 проб сывороток больных КЭ и доноров из Омской и Курганской областей в РТГА с коммерческим диагностикумом КЭ (НПО "Вирион", г.Томск) и экспериментальным диагностикумом из штамма Тенис вируса КЭ, в 47,5% случаев наблюдали двукратное, в 7% - четырехкратное превышение титров антител с экспериментальным диагностикумом, в остальных случаях выявляли равные титры.

Использование диагностикума для РТГА на основе штамма Тенис вируса КЭ позволяет экономить сырье для получения человеческого иммуноглобулина против КЭ из сывороток крови лиц, проживающих в урало-сибирском регионе за счет использования считавшимися ранее технологически непригодными низкотитражных (1:10-1:20) в РТГА с коммерческим диагностикумом сывороток доноров, более высокие титры которых выявляются с диагностикумом, приготовленным из штамма Тенис.

Использование штамма Тенис вируса КЭ в качестве продуцента диагностических препаратов, в том числе ГА диагностикума для РТГА и КС диагностикума для РСК, позволяет повысить специфичность серологической и вирусологической диагностики КЭ и эффективность дифференциальной лабораторной диагностики омской геморрагической лихорадки и КЭ в урало-сибирском регионе. Использование ГА и КС диагностикумов на основе штамма Тенис позволяет повысить эффективность диагностики в случаях серонегативных, атипичных и хронических форм заболеваний КЭ в урало-сибирском регионе.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Сыворотки крови от больных людей, взятые в начальном периоде и в динамике заболевания, исследуют в РТГА с использованием антигена штамма Тенис вируса КЭ (ГА диагностикум КЭ из штамма Тенис).

Практический пример: Сыворотки крови больного Д-ва (28 лет, Тарский район Омской обл.) с клиническим диагнозом "КЭ", взятые при поступлении в стационар и на 6-й день заболевания, исследовали в РТГА с коммерческим диагностикумом КЭ (НПО "Вирион", г.Томск) и антигеном штамма Тенис вируса КЭ. По результатам РТГА с коммерческим диагностикумом (в 1-й сыворотке титр антител - 0, во 2-й 1:10) сделано заключение: результат сомнительный ввиду отсутствия диагностического (4-х кратного) нарастания титров антител в парных сыворотках, необходимо исследование 3-й сыворотки больного, взятой на 2-3 неделе заболевания. По результатам РТГА с антигеном штамма Тенис (в 1-й сыворотке титр антител - 0, во 2-й 1:40) сделано заключение: выявлено 4-х кратное нарастание титра антител к вирусу КЭ, лабораторный диагноз - "КЭ".

Пример 2. Отбор сырья для получения человеческого иммуноглобулина против КЭ проводят путем исследования проб сывороток крови доноров в РТГА с использованием антигена штамма Тенис вируса КЭ (ГА диагностикум КЭ из штамма Тенис).

Практический пример: Сыворотки крови 10 доноров из Омской области исследовали в РТГА с коммерческим диагностикумом КЭ (НПО "Вирион", г.Томск) и антигеном штамма Тенис вируса КЭ. По результатам РТГА с коммерческим диагностикумом выявлено, что 5 гемимаконов крови по 200,0 мл технологически непригодны как сырье для получения человеческого иммуноглобулина против КЭ ввиду низких (менее 1:20) титров антител у доноров. По результатам РТГА с антигеном штамма Тенис вируса КЭ титры выше 1:20 выявлены у 9 доноров, что позволяет использовать еще 4 гемимакона в качестве сырья.

Изобретение относится к вирусологии. Получен штамм вируса клещевого энцефалита, депонированный в Государственной коллекции вирусов ГУ НИИ им. Д.И.Ивановского РАМН под №821. Изобретение может быть использовано в качестве продуцента диагностических препаратов, а также для оптимизации лабораторной диагностики, экстренной специфической профилактики и терапии клещевого энцефалита в России.

Штамм вируса клещевого энцефалита семейства Flaviviridae, рода Flavivirus, сибирского подтипа, депонированный под №821 в Государственной коллекции вирусов ГУ НИИ им. Д.И.Ивановского РАМН, для получения диагностических препаратов.