СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Российский патент 1996 года по МПК A61K39/42 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается производства медицинских иммунобиологических препаратов, в частности, препаратов для диагностики клещевого энцефалита.

Известно, что поликлональные антитела могут быть получены путем иммунизации каких-либо животных-продуцентов с последующим забором различных биологических жидкостей и выделением из них иммуноглобулина. Чаще всего источником антител служит кровь или асцитические жидкости. Для получения последних иммунизированным животным в полость брюшины вводят асцитобразующий материал: клетки асцитической опухоли или полный адъювант Фрейнда (1,6).

Наиболее распространено использование иммунных асцитических жидкостей (ИАЖ) мышей, однако имеются сведения о возможности получения ИАЖ крыс против возбудителей различных заболеваний, в том числе против вируса клещевого энцефалита. Отмечено, что белые крысы в качестве продуцентов асцитической жидкости имеют ряд преимуществ по сравнению с мышами. Они менее подвержены спонтанным инфекционным заболеваниям и объем получаемой от них асцитической жидкости в 5 10 раз больше. Опухоль яичника крысы, штамм "ОЯ", которую, используют для индукции асците у этих животных, обладает 100%-ной прививаемостью, в отход вследствие преждевременной гибели крыс (до накопления ИАЖ) составляет не более 10% (3,8).

Известно, что препараты для диагностики клещевого энцефалита производят на основе кроличьих или лошадиных сывороток или на основе ИАЖ мышей (5, 7, 9, 10, 11, 12). Кроличьи и лошадиные сыворотки, кроме противовирусных, содержат антитела к гетерологичной ткани мозгу мышей, так как полноценный антиген для их иммунизации может быть получен лишь на чувствительных к вирусу клещевого энцефалита животных, но кролики и лошади таковыми не являются. Гетерологичные антитела являются причиной неспецифических реакций, поэтому для производства высокоспецифичных диагностических препаратов необходимо выделение "чистых" противовирусных антител класса G или Fab-фрагментов иммуноглобулинов (2, 7, 10). Проведение таких операций значительно усложняет технологический процесс и сводит к минимуму основное преимущество этой модели для организации широкомасштабного производства возможность получения исходного сырья в большом объеме.

Ближайшим по технической сущности прототипом предлагаемого нами способа получения антител являются ИАЖ мышей против вируса клещевого энцефалита. Для них характерно содержание специфических антител в высокой концентрации и практическое отсутствие противотканевых антител, так как иммунизацию проводят гомологичным антигеном мозгом инфицированных мышей-сосунков. ИАЖ мышей используют в качестве контрольных антител в различных серологических реакциях, кроме того, на их основе разработаны технологии приготовления различных диагностических препаратов: люминисцирующего иммуноглобулина, эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации, иммуноферментных тест-систем для индикации вируса клещевого энцефалита и антител к нему (4, 5, 7, 9, 12). Основное преимущество этих препаратов высокая активность и специфичность и, следовательно, чувствительность.

Процесс получения ИАЖ мышей состоит в следующем (4, 6). Самок нелинейных белых мышей массой 20 22 г иммунизируют высокоактивным антигеном вируса клещевого энцефалита. Для этого вирус 2 3 раза пассируют путем внутримозгового заражения мышей-сосунков, готовят 10% -ную мозговую вируссодержащую суспензию на 0,9%-ном растворе натрия хлорида, осветленную центрифугированием при 3000 10000 об/мин. Так как вирус клещевого энцефалита патогенен для мышей при любых способах заражения, их предварительно вакцинируют проводят 2 3 инъекции с интервалом 7 дней антигеном, инактивированным бетапропиолактоном или формалином, в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда или без него. Затем через 2 3 недели следует цикл иммунизации неинактивированным антигеном, состоящий также из 2 3 инъекций с интервалом 7 дней с адъювантом или без него, или сначала вводят разрешающую дозу вируса (вируссодержащую мозговую суспензию в разведении 10^-4 10 ⁶), а еще через 3 недели проводят цикл иммунизации выживших животных. На всех этапах доза антигена составляет 0,2 мл в смеси с адъювантом или 0,1 мл без него. Способ введения внутрибрюшинный.

Известен также способ иммунизации мышей хлороформенным антигеном - 10% -ной вируссодержащей мозговой суспензией, очищенной хлороформом и центрифугированием по специальной методике, вирус в которой инактивирован лишь частично (7, 11). Схемы состоят из однократной или двукратной с интервалом 6
7 дней первичной иммунизации и последующей через 28 45 дней 3-х 4-х кратной с интервалом 1 3 дня реиммунизации. Дозы антигена такие же, как описано выше, способ введения внутримышечный и внутрибрюшинный. По окончании иммунизации через 1 3 дня мышам прививают внутрибрюшинно 2 4 млн. клеток опухоли-асцит-саркомы мышей 180 TG для накопления асцитической жидкости. Линию опухолевых клеток поддерживают непрерывными внутрибрюшинными пассажами каждые 10 14 дней на самках нелинейных белых мышей массой 18 20 г. для длительного хранения помещают в криозащитной среде в жидкий азот. Асцитическую жидкость извлекают из брюшной полости шприцем с толстой иглой, у выживших животных эту операцию повторяют через 3 5 дней. От одной мыши можно получить от 5 до 10 15 мл ИАЖ. После освобождения низкосортным центрифугированием от опухолевых клеток, надосадочную жидкость, в которой содержатся антитела, помещают на хранение при температуре минус 20 40 ^oC, после оттаивания вновь центрифугируют при 4000 6000 об/мин в течение 15 20 минут для удаления фибрина, выпавшего в осадок, и используют для выделения иммуноглобулина.

Иммуноглобулин из ИАЖ мышей выделяют различными методами: высаливанием насыщенным раствором сернокислого аммония или спиртовым осаждением на холоде, с доочисткой гель-фильтрацией через Сефадекс С-200 или без нее, в зависимости от требований, предъявляемый к степени очистки иммуноглобулина технологией приготовления того или иного препарата (5, 7, 10, 12).

Недостатками вышеописанного способа получения антител против вируса клещевого энцефалита являются: необходимость предварительной вакцинации мышей инактивированным антигеном; гибель, несмотря на это, 30 50% и более животных в процессе иммунизации из-за их высокой чувствительности к вирусу при любых способах заражения; дополнительные потери до 20% иммунизированных мышей после введения асцитической опухоли часть их не накапливает ИАЖ, так как асцит-саркома 180 ТС не обладает 100%-ной прививаемостью. Кроме того, объем получаемой асцитической жидкости от одного животного-продуцента невелик. Эти недостатки ограничивают масштаб производства препаратов на основе ИАЖ мышей и приводят к его высокой трудоемкости и нерентабельности.

Задачей изобретения является получение антител, позволяющей в условиях эффективного широкомасштабного производства иметь высокоактивное, авидное, универсальное сырье, пригодное для изготовления диагностических препаратов клещевого энцефалита.

Предлагаемый нами способ основан на модели ИАЖ крыс. Отличительной особенностью является то, что в качестве животных-продуцентов используют крыс линии "Wistar", иммунизацию проводят гомологичным антигеном-суспензией мозга крысят с активностью вируса не менее 9,5 lg ЛД 50/мл по рациональным схемам, состоящим из 3 5 инъекций в дозе 1 мл и 3 мл на заключительном этапе с интервалом 1,5 2 месяца, который обязателен между первым и вторым введением антигена и может быть сокращен до двух-трех недель между последующими. Накопление асцитической жидкости индуцируют введением клеток опухоли яичника крысы, штамм "ОЯ". Выделение иммуноглобулина для дальнейшего производства на его основе диагностических препаратов проводят полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000, для этой цели используют ИАЖ, отконтролированные на специфическую активность и авидность.

Пример. Крыс линии "Wistar" массой 180 220 г. иммунизируют вирусом клещевого энцефалита в виде гомологичного антигена. Для этого производственный штамм 3 4 раза пассируют путем внутримозгового заражения 1 3 дневных крысят, готовят 10%-ную мозговую вируссодержащую суспензию на среде 199 или 0,9%-ном растворе натрия хлорида pH 7,2 7,4, осветляют центрифугированием при 3000 6000 об/мин и используют надосадочную жидкость. Антиген вводят по схеме, состоящей из трех внутрибрюшинных инъекций с интервалом 42 45 дней, в количестве 1 мл на всех этапах, кроме последнего, на котором вводят 3 мл. Инфекционная активность антигена при интрацеребральном заражении нелинейных белых мышей массой 7 8 г должна быть не ниже 9,5 ЛД 50/мл.

Схема обеспечивает выход в продуценты высокоактивного и авидного сырья, пригодного для изготовления компонентов иммуноферментной тест-системы и люминесцирующего иммуноглобулина, около 60% крыс. Для увеличения количества животных, дающих сырье высокого качества, необходимое для приготовления выше перечисленных препаратов, схему иммунизации изменяют как по продолжительности интервала между введениями антигена, так и по их количеству, увеличивая до 4 5. Сохранение длительного интервала (лучше 2 месяца) между первой и второй инъекциями обязательно, между последующими он может быть сокращен до 2 3 недель, причем последние "удары" могут быть сдвоенными с промежутками 2 5 дней. Тем не менее, соблюдение по возможности больших интервалов (1,5 2 месяца) между всеми инъекциями эффективнее для повышения авидности ИАЖ. По окончании иммунизации через 1 3 дня животным прививают опухоль яичника крысы (штамм "ОЯ") для индукции асцита. Данная линия опухолевых клеток получена авторами в ВОНЦ г. Москвы. В жизнеспособном состоянии клетки поддерживают непрерывными внутрибрюшинными пассажами на крысах линии "Wistar", массой 180
220 г. каждые 8 10 дней. Операция по пассажу опухоли заключается в следующем: асцитическую жидкость, полученную от крысы-донора, используют для приготовления суспензии опухолевых клеток. Каждой крысе-рецепиенту вводят внутрибрюшинно по 1 мл суспензии. Первую порцию ИАЖ забирают, как правило, на 8 12 день после прививки опухоли, вторую и последующие порции, если животное выдерживает, по мере накопления асцитической жидкости. Эту операцию выполняют под хлороформенным наркозом при помощи шприца с толстой иглой, сделав прокол брюшной стенки крысы снизу и сбоку от средней линии. ИАЖ собирают во флаконы со стеклянными бусами, добавляют хлороформ в количестве приблизительно 10% от объема асцитической жидкости, встряхивают 5 7 минут, помещают при температуре (±37^oC) на 30 40 минут, затем на 18 - 20 часов при температуре от 4 до 10^oC, после чего центрифугируют 30 40 минут при 5000 6000 об/мин. Надосадочную жидкость контролируют в различных иммунологических тестах для определения специфической активности и авидности, хранят при температуре не выше минус 18^oC. Специфическую активность ИАЖ определяют в реакциях связывания комплемента (РСК), торможения гемагглютинации (РТГА), непрямым методом флюоресцирующих антител (НМФА). Функциональную активность (авидность) по показателю степени чувствительности сыворотки в кинетической реакции радиального гемолиза (РРГ) (II). Контроль проводят с использованием коммерческих препаратов: диагностикума клещевого энцефалита для РТГА, РСК, РРГ, РТНГА по ФС 42-38ВС-87 и сыворотки диагностической антивидовой против иммуноглобулинов крысы по ТУ 42.14.81-76.

Для приготовления компонентов иммуноферментной тест-системы для индикации вируса клещевого энцефалита-иммуноглобулина G и конъюгата пригодны ИАЖ с титром антител в РСК не ниже 1: 64, в РТГА не ниже 1:320 и степенью чувствительности не ниже 0,6. Для изготовления иммуноглобулина диагностического люминесцирующего необходимы асцитические жидкости с активностью в НМФА не ниже титра 1:320 и степенью чувствительности не ниже 0,6.

Выделение иммуноглобулина из ИАЖ крыс производят методом осаждения полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000 в различных модификациях с последующей доочисткой, если это необходимо, на колонках с Сефадексом G-200.

Асцитические жидкости, не отвечающие по качеству выше приведенным требованиям, используют для приготовления контрольных сывороток для РТГА и РСК, в частности, в производстве коммерческого препарата-диагностикума клещевого энцефалита для РТГА, РСК, РРГ, РТНГА.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить антитела, пригодные для производства диагностических препаратов клещевого энцефалита, без больших материальных трудозатрат в достаточно большом количестве. От одной крысы можно получить 40 250 мл ИАЖ, не уступающей по качеству аналогичной ИАЖ мышей. Взрослые крысы невосприимчивы к вирусу клещевого энцефалита, поэтому исключается их гибель в процессе иммунизации и нет необходимости в какой-либо инактивации антигена. В то же время при интрацеребральном заражении новорожденных крыс развивается типичная картина заболевания, вирус клещевого энцефалита накапливается в головном мозге этих животных в большом количестве, что позволяет получать высокоактивный, полноценный, гомологичный антиген для иммунизации. Предлагаемые схемы иммунизации, основанные на феномене иммунологической памяти, просты и достаточны эффективны без применения адъювантов. Эффект повышается, если ИАЖ, полученные от группы крыс по той или иной схеме, используют комплексно: в производстве как сложных препаратов на основе антител с высокой специфической и функциональной активностью, так и простых, таких как контрольные сыворотки для РТГА и РСК. В этом случае в работу берут асцитические жидкости всех проиммунизированных животных и потери (не более 10%) определяются лишь преждевременной гибелью крыс после инокуляции асцитической опухоли, до накопления ИАЖ.

Использование: биотехнология, производство медицинских иммунобиологических препаратов, в частности, препаратов для диагностики клещевого энцефалита. Сущность изобретения: для осуществления способа проводят иммунизацию крыс линии "Wistar" гомологичным антигеном вируса клещевого энцефалита - суспензией мозга крысят с активностью вируса не менее 9,5 lg ЛД 50/мл - по рациональным схемам, состоящим из 3 - 5 инъекций с обязательным интервалом 1,5 - 2 месяца между первой и второй, который может быть сокращен до 2 - 3 недель между последующими введениями антигена, накопление асцитической жидкости индуцируют инокуляцией клеток опухоли яичника крысы, выделение иммуноглобулина производят полиэтиленгликолем.

Способ получения антител для производства диагностических препаратов вируса клещевого энцефалита путем иммунизации животных-продуцентов с последующей индукцией асцита и выделением иммуноглобулина, отличающийся тем, что из животных-продуцентов используют крыс линии " Wistar", иммунизацию проводят суспензией мозга инфицированных крысят с активностью вируса не менее 9,5 lg ЛД_50/мл по схемам, состоящим из 3 5 инъекций с интервалом 1,5 2 месяца между первой и второй инъекциями и интервалом 2 3 недели между последующими введениями антигена, индукцию асцитной жидкости проводят введением клеток опухоли яичника крысы, а иммуноглобулин выделяют полиэтиленгликолем.