Способ титрования энтомопатогенных вирусов Советский патент 1984 года по МПК C12N7/00 

СП

ел I Изобретение относится к способам количественного определения инфекционности вирусов, применяемых для биологической борьбы с насекомыми-вредителями лесов и сельскохозяйственных культур. Согласно рекомендации ВОЗ, в качестве биоинсектицидов для насекомых - вредителей выбрана группа бакуловирусов lj . Важнейшей характеристикой биоинсектицидов как вирусных препаратов является их инфекционность, поэтому актуальная разработка методов определения инфекционности таких препаратов. Инфекционность вирусных препаратов определяют на насекомых и на перевиваемых культурах клеток насекомых, которые в последние годы получают все большее развитие, открывая возможности излучения вирусов в стандартных условиях. Приемы, используемые в работе с культурами клеток насекомых, основаны на методах, ранее разработанных для культур клеток позвоночных. Известен способ титрования энтопатогенных вирусов, включаюп| 1Й заражение культуры клеток вирусом и анализ зараженных клеток, например, по бляшкам 2. Однако положительный результат титрования методом бляшек зависит от многих факторов, например от качества- питательных сред, посуды, физиоло гического состояния культуры, которое не всегда позволяет получить хороший монослой. Основное условие при постановке метода бляшек - заданные сроки и необходимое количество. Кром ТОГО, постановка метода бляшек обусловливается использованием дорогостоящей импортной агарозы, что затрудняет применение метода в широком масштабе. Титрование по бляшкам не применимо также и для тех вирусов ядерного полиэдроза, которые не образуют бляшки в чувствительной культуре, а также в тех случаях, когда чувствительная культура находится в суспен зионном или полусуспензионном состоя нии. При изучении культуры клеток нас комых, зараженной вирусом ядерного полиэдроза, установлено подавление синтеза клеточной ДНК в сравнении с незараженными культурами, что conpoволсдается подавлением роста клеток. 55г Целью изобретения является повышение точности способа титропания энтомопатогенных вирусов. Цель достигается тем, что анализ зараженных клеток проводят по признаку подавления деления зараженных клеток. Пример. Для титрования готовили десятикратные разведения исходного вирусного материала, представляющего собой культурапьную жидкость, содержащую внеклеточный свободный вирус ядерного полиэдроза тутового шелкопряда, полученный из культуры клеток непарного шелкопряда SCLd-135, зараженных вирусом ядерного полиэдроза тутового шелкопряда. Разведения готовили на свежей питательной среде. Затем по 0,2 мл каждого разведения вносили в пробирки. На разведение брали по четыре пробирки. По 0,2 мл питательной среды вносили и в четыре контрольные пробирки. Готовили клеточную суспензию и по 0,8 мл вносили в пробирки с разведенным вирусным материалом. Суспензию готовили с таким расчетом, чтобы в каждую пробирку попадало одинаковое количество кглеток (1-3 10клеток/м.п) . Не сливая вирус, пробирки инкубировали в термостате при 28 С в течение 10-12 дн. в опытах с вирусом ядерного полиэдроза тутового шелкопряда, вирусом ядерного полиэдроза большой вощинной моли и вирусом ядерного полиэдроза непарного шелкопряда. На 7-й день отбирали по две пробирки каждого разведения вируса ядерного полиэдроза и учитывали общее количество клеток в каждой пробирке. Подсчет клеток производили в счетной камере Горяева с точностью + 1-3-10 клеток/мл. Учет на более поздние сроки производили с целью установления возможного прироста клеток в пробирках с низкой множественностью заражения. К этому времени количество клеток в контрольной культуре увеличивалось в несколько раз,что обеспечивало более Четкое определение разведения, дающее эффект подавления роста клеток. Результаты учета показали, что вирусосодержащий материал в разведении 10 еще подавляет рост клеток, тогда как разведение 1.0 таким эффектом не обладает. Концентрацию вируса выражали в условных единицах подавления роста клеток на 1 мл зараженной клеточ311ной суспензии - ЕПРК/мл. За единицу активности принималось минимальное количество вирусосодержащего материала, которое еще вызывало подавление роста клеток. Так, для вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда титр составлял ЕПРК/мп. Сравнив ли результаты титрования по ПРК с данными титрования по бляшкам. Титр вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда по бляшкам составлял бляшкообразующих единицу на 1 мп. Та ким образом, для данной системы: вир ядерного полиэдроза тутового шелкопряда - клетки непарного шелкопряда SCLd-135 чувствительность титрования по ПРК примерно на порядок выше, чем по бляшкам. Аналогичные результаты получены при титровании вируса ядерного полиэдроза большой вощинной моли, вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда. Для этих вирусов титрование по ПРК также оказалось более чувствительным, чем другими методами (см. таблицу). Сравнение чувствительных трех способов титрования вирусов ядерного полиэдроза приведено в таблице. Поскольку вирус ядерного полиэдроза непарного шелкопряда в культуре клеток непарного шелкопряда IPL образует бляшки, а полиэдры образуются только в единичных клетках начальных разведений ( 10 ), титр этого вируса ядерного полиэдроза определяли только по методу ПРК. Результаты проведенных опытов воспроизводимы для всех испытуемых систем. Из приведенных данных можно сделать вывод, что предлагаемый способ титрования :энтопатогенных вирусов в культуре клеток насекомых позволяет определить инфекционность широкого круга вирусов, т.е. всех тех вирусов, которые при размножении в культуре подавляют рост клеток, не вызывая их разрушения.

СПОСОБ ТИТРОВАНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ВИРУСОВ, включающий заражение культуры клеток вирусом и анализ зараженных клеток, отличающийся тем, что, с целью повы.шения точности, анализ зараженных .клеток проводят по признаку подавления деления зараженных клеток.

Клетки SCL d 135 - вирус ядерного полиэдроза тутового шелкопряда

Клетки SCL d 135 - вирус ядерного полиэдроза большой вощинной моли

Клетки 1PL В 65г- вирус ядерного нолиэдроза непарного шелкопряда 5

Т, Т

10

4-10

10

2-10

6,Т

10