Способ выделения ферредоксина Советский патент 1986 года по МПК C12N9/02 

1

Изобретение относится к биохимии, а именно к способу получения высокоочищенных ферментных препара тов, и может быть использовано в производстве ферментных препаратов, а также в научных исследованиях по биохимии и физиологии растений, молекулярной биологии,

Целью изобретения является повышение фотовосстановительной активности, увеличение выхода целевого продукта и сокращение времени его выделения ,

12

сульфата аммония и через 0 мин цен трифугируют при указанном режиме в течение 10 мин. Осадок, содержащий ферредоксин, растворяют в 40 мл 5 0,05 М трис-НС буфере, 0,01 М МЭ рН 9 и центрифугируют при 6 тыс, об/мин в течение 5 мин для удалени балластных белков, Супернатант под вергают обессоливанию и очистке от 10 высоко- и низкомолекулярных вещест путем фильтрования через колонку (40 X 4,0 см) с сефадексом G-50, уравновешеньую 0,05 М трис-НСI рН 8,2, 0,01 М МЭ, Белок элюируют

Цель заключается в томс что согласно способу вьщеления ферредоксина fs тем же буфером,

из высших растений, включающему гомо- Обессоленный белковый раствор с генизацию сырья и стадии очистки: фракционирование сульфатом аммония, гельфильтрацию на сефадексе и ионцоферредоксиновой активностью сят на колонку размером (3 х 1,5 с с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной

обменную хроматографию на ДЭАЭ-целлю- 20 0,05 М трис-НС1 буфером рН 8,2,

лозе, используют листья 4-5-недель- ных растений, гомогенизацию сырья проводят в буфере в соотношении 1:5 с добавлением 0,35 - 0,50 М NaC и 0,01 - 0,02 М меркаптоэтанола,

Пример 1, Свежие листья 4- 5-недельных растений гомогенизируют в буфере в соотношении 1:5 с добавлением 0,35-0,50 М NaC и 0,01 - 0,02 М меркаптоэтанола, Гомогенат отжимают и проводят фракционное высаливание с последующим центрифугированием. Первый осадок отбрасывают. Второй осадок используют для получения ферредоксина, которьш растворяют в трис-НС1 буфере и обессоли- вают на сефадексе G-50, Дальнейшую очистку ферредоксина проводят с использованием двухкратной хроматографии на ДЭАЭ-целяюлозе,

Пример 2, Растения пшеницы сорта Московская 35 выраш;ивают в открытом грунте. Навеску свежих листьев (четырехнедельные растения)

0,3 М NaC, 0,01 М МЭ, Колонку по ледовательно промывают 0,05 М три НС буфером рН 8,2 с добавкой 0, 0,15 М NaC. Ферредоксин злюируют

25 0,1 М трис-НС1 буфером с добавкой 0,17 М NaCl, Ноннообменную / хрома графию проводят повторно на колон (1x1 см) с ДЭАЭ-целлкшозой, Ферре доксин хранят при 0°С под азотом

30 или в замороженном состоянии при 20°С в течение длительного времен без потери активности.

В табл. 1 пр иведены результаты получения $елка из 100 г листьев

35 пшеницы сорта Московская 35,

Гомогенность вьщеляемых белков доказана седиментационным равнове сием на аналитической ультрацентр фуге, модель Е, при электрофорезе

40 в 10%-ном полиакрштамидном геле.

Активность ферредоксина опреде ляют по скорости фотовосстановлен НАДФ хлоропластами пшеницы в реак ционной смеси следующего состава

100 г гомогенизируют в 500 г буфер- 45 мкмоль MgCf Ю; НАДФ 0,6;

М

ной смеси следующего состава, М: трис-НС 0,05 (рН;8,2); 0,35 NaCl ; 0,01 Ю (т,е, в соотношении 1:5), в гомогенизаторе в течение 2 мин. Полученную темно-зеленую массу фильтруют через полотно.

Фракционное осаждение балластных : белков проводят из гомогената листьев, добавляя соль из расчета 25 г сульфата аммония на 100 мл раствора. После центрифугирования при 6000 об/мин в течение 10 мин осадок отбрасывают а к супернатанту добавляют 36 г

фер,уе,,оксина; 0,05 М трис-НС С бу (рН 8,2), 10 у -хлорофилла.

Пример 3, Вьщеление ферр доксина из листьев пшеницы ведут

50 аналогично примеру , но с исполь зованием механического измельчени замороженных листьев в соотношени листья:буфер :2 и без добавок, с жают выход белка в 1,5 - 2 раза и

55 активность в 1,5 раза.

П р и М е р 4, Выделение ферр доксина из листьев люцерны, выращ ной в открытом грунте, ведут анап

56402

сульфата аммония и через 0 мин центрифугируют при указанном режиме в течение 10 мин. Осадок, содержащий ферредоксин, растворяют в 40 мл 5 0,05 М трис-НС буфере, 0,01 М МЭ, рН 9 и центрифугируют при 6 тыс, об/мин в течение 5 мин для удаления балластных белков, Супернатант подвергают обессоливанию и очистке от 10 высоко- и низкомолекулярных веществ путем фильтрования через колонку (40 X 4,0 см) с сефадексом G-50, уравновешеньую 0,05 М трис-НСI рН 8,2, 0,01 М МЭ, Белок элюируют

fs тем же буфером,

Обессоленный белковый раствор с

ферредоксиновой активностью сят на колонку размером (3 х 1,5 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной

0,3 М NaC, 0,01 М МЭ, Колонку последовательно промывают 0,05 М трис- НС буфером рН 8,2 с добавкой 0,1 М, 0,15 М NaC. Ферредоксин злюируют

0,1 М трис-НС1 буфером с добавкой 0,17 М NaCl, Ноннообменную / хрома то- графию проводят повторно на колонке (1x1 см) с ДЭАЭ-целлкшозой, Ферредоксин хранят при 0°С под азотом

или в замороженном состоянии при 20°С в течение длительного времени без потери активности.

В табл. 1 пр иведены результаты получения $елка из 100 г листьев

пшеницы сорта Московская 35,

Гомогенность вьщеляемых белков доказана седиментационным равновесием на аналитической ультрацентрифуге, модель Е, при электрофорезе

в 10%-ном полиакрштамидном геле.

Активность ферредоксина определяют по скорости фотовосстановления НАДФ хлоропластами пшеницы в реакционной смеси следующего состава:

М

фер,уе,,оксина; 0,05 М трис-НС С буфера (рН 8,2), 10 у -хлорофилла.

Пример 3, Вьщеление ферредоксина из листьев пшеницы ведут

аналогично примеру , но с использованием механического измельчения замороженных листьев в соотношении листья:буфер :2 и без добавок, снижают выход белка в 1,5 - 2 раза и

активность в 1,5 раза.

П р и М е р 4, Выделение ферредоксина из листьев люцерны, выращенной в открытом грунте, ведут анапо220

3

гично примеру 1, Выход ферредоксина 3,5 - 4 мг на 100 г листьев с фотовосстановительной активностью мкмоль НАДФН

мг.хф ч

Пример 5, Вьщеление ферредоксина из листьев гороха, выращенного в открытом грунте, ведут аналогично примеру 1. Выход ферредоксина 3-3,5 мг на 100 г листьев с фотовосстановительной активностью 120

мкмоль НАДФН мгхф ч

Пример 6. Выделение ферредоксина из листьев огурцов, выращенных в открытом грунте, ведут аналогично примеру 1. Выход ферредоксина 3,0-3,5 мг на 100 г листьев с фотовосстановительной активностью мкмоль НАДФН

180

мг-хф -ч

в табл. 2 дана активность предлагаемого ферредоксина и выход белка из 100 г листьев пшеницы сорта Московская 35, люцерны, огурцов, гороха в сравнении с известным.

Пример 7. Граничные и оптимальные значения NaCi 0,35-0,5 М и меркаптоэтанол 0,01-0,02 М.

Результаты опытов даны в табл. 3.

Пример 8. Запредельные значения параметров.

Гомогенат из листьев

Второй осадок Сефадекс G-50 ДЭАЭ-целлюлоза ДЭАЭ-целлюлоза

10

5

556404

При изменении каждого из параметров все остальные оптимальны (как в примере 1).

Результаты даны в табл. 4. 5 Пример 9. Влияние соотношения зеленый материал:буфер на выход выделенного белка показано в т абл. 5.;

Пример 10. Выход ферредоксина в зависимости от возраста растений дан в табл. 6.

Пример 11. Сокращение времени получения предлагаемого ферредоксина за счет исключения и сокращения ряда операций позволяет провести весь процесс за 4,5-5 ч, тогда как известного за 30-48 ч.

Результаты опытов даны в табл. 7.

Преимуществом предлагаемого способа по сравнению с известным является использование комбинации стадий очистки - гомогенизации сырья в буфере при массовом соотношении листья:буфер 1:5 с добавлением 0,35 М - 0,5 М и 0,01 - 0,02 М мер- каптоэтанола в сочетании с фракционным осаждением сульфатом аммония, что позволяет увеличить выход целевого продукта в 1,5 - 2 раза с получением более высокоактивного ферредоксина с высокой степенью чистоты и сократить время его получения до 4,5 - 5 ч.

0

5

0

Т а

лица

Люцерна Пшеница сорта

Характеристики

Концентрация, М NaCl Меркаптоэтанол

т,МГ

Выход, 7пл

100 г листьев пшеницы

. мкмоль НАДФН Активность, т--

МГ Хфч

NaCl

Меркаптоэтанол

Таблица 2

ПО

220

3,5-4,0 2,0-2,5

Показатели

0,35 0,42 0,50 0,0 0,015 0,02

44,5

200 200

180

Таблица 4

3,1 3,0

3,5 3,9

200 190

150 160

Соотношение Выход белка листья:буфер

1:6 Очень сильное разбавление белков, экстрагируемых из листьев, что влечет за собой потерю до 10% белка.

Трудно работать на центрифуге с большими объемами раствора белков.

1:2 Ферредоксин извлекается из листьев не полностью

Эти значения оптимальны для 100% выхода ферредоксина

Таблица 6

астенияВыход ферредоксина

мг

--5--- по способу

100 г листьев

. ,

известному предлагаемому

Люцерна

двухнедельные проростки

4-5-недельные растения

Горох

двухнедельные проростки

4-5-недельные растения

Огурцы

двухнедельные проростки

4-5-недельные растения

jf.

Эти определения авторы раньше не проводили I (с растениями 4-5-недельного.возраста).

12556408

Таблица 5

2,2-2,5 3,5-4

2,2-2,6 3,0-3,5

2,2-2,4 3,0-3,5

Измельчение материала

Экстракция (размораживание)

Первое высаливание Центрифугирование

Второе размораживание

Центрифугирование

Обессоливание на сеф дексе

G-50 мелкий

G-50 средний

Редактор Н. Гулько

Составитель В, Соина

Техред Л.Олейник Корректор И. Эрдейи

Заказ 4787/29Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1255640 10

Таблица 7

0-10

1-00