Способ определения литической активности веществ Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к клинической медицине и экспериментальной био логии и, в частности, к изучению действия литических агентов, например кислот, щелочей, детергентов и т.п., на мембраны эритроцитов, а так же может быть использовано в промышленности для определения концентрации сапонина в вытяжках лекарственного сырья и в онкологии для определения селективной литической активности веществ в отношении опухолевых клеток. Известен способ определения литической активности поверхностно-актив ных веществ (ПАВ) от их концентрации (1 J и ,23, предусматривающий регистрацию кинетики лизиса эритроцитов с постоянной концентрацией под действием ПАВ при различных концентрациях изучаемых веществ фотометрически, по измерению изменения интенсивности поглощения света взвесью эритр цитов. Критерием литической активнос ;Ти служит время лизиса 50% клеток T.Q, регистрируемое для различных концентраций исследуемого вещества. По полученным данным строят графичес кую зависимость литической активност веществ от их концентрации. Существенными недостатками этого способа являются значительные затрат времени, так как для построения одно кривой необходимо большое количество данных - до 10, причем для получения каждого из них затрачивается от 0,5 до 20 мин; неточность разведения вно сит значительные погрешности в регистрируемые показатели, построение графической зависимости по дискретным значениям концентраций не дает истинного представления о взаимосвязи концентрация-эффект, так как возможн потери аномальных областей, где исследуемое вещество может проявлять неожиданно высокую или низкую актив.ность. Цель изобретения - повышение точности измерений и сокращение времени анализа. Указанная цель достигается тем, что согласно cnoccf6y определения литической активности веществ, заключающемуся в смешивании клеток постоянной концентрации с лизирующим веществом различной концентрации, определении времени лизиса 50% клето по изменению оптической плотности, смешивание клеток с лизирующим ве14 ществом производят в непрерывном потоке, а изменение оптической плотносТи определяют путем постоянного слежения за точкой 50% лизиса во всем диапазоне концентраций лизирующего вещества. Сущность изобретения заключается в том, что в способе определения литической активности веществ смешивание клеток с лизирующим веществом производят при непрерывной подаче в проточную кювету суспензии клеток с постоянной концентрацией и раствора вещества с градиентом кон центрации во времени при постоянном соотношении скоростей потоков. От момента смешивания и до лизиса клеток проходит определенное время, зависящее от концентрации вещества и его литической активности: чем больше концентрация и литическая активность вещества, тем меньше требуется времени от момента смешивания до лизиса клеток, тем меньшее расстояние проходят клетки по проточной кювете. Непрерывное слежение за заданной величиной оптической плотности или светорассеяния, соответствующей выбранному значению, например 50% содержанию клеток, осуществляют измерительный оптрон, в оптической части которого помещают проточную кювету. Проведение анализа в проточной кювете с использованием градиента концентрации вещества во времени и развертка процесса во времени позволяют исключить регистрацию литической активности для дискретных концентраций вещества, что значительно ускоряет проведение анализа и повышает точность измерений. На чертеже показана зависимость литической активности сапонина от концентрации. Пример. Определение зависимости гемолитического эффекта сапонина фирмы Мерке от концентрации по предлагаемому способу. Используют свежевзятую кровь человека. Эритроциты трижды отмывают в 10-кратном объеме физиологического раствора. Отмытые эритроциты суспендируют в физиологическом растворе до концентрации 34 тыс.клеток на мм. Предварительно, до проведения анализа, находят величину оптической плотности (светорассеяния), соответствуюую 50% содержанию красных клеток осле разведения 1:1, и следящую 3 систему устанавливают на на1аденное значение. В проточную кювету подают сапонин, приготовленный на физиологическом растворе, с убывающей во времени по экспоненциальному закону концентраций и стандартно разведенную взвесь эритроцитов с соотношение скоростей потоков 1:1. В результате в рабочей кювете -содержание клеток составляет 17 тыс.шт./мм, а .концент рация сапонина убывает с до . Система слежения обеспечивает автоматическое перемещение оптрона вдоль проточной кюветы до точки, - соответствующей 50% содержанию эритр цитов, и поддерживает оптрон над данной точкой. Смещение оптрона вдоль проточной кюветы служит мерой литической активности вещества, а развертка процесса во времени даёт Зависимость литической активности са понина от концентрации (см.чертеж). Развертка по оси абсцисс соответствует концентрации препарата, а по оси ординат - времени 50% гемолиза. Кривая 1 соответствует эквиконцен рацнонным линиям, кривая 2 пропи 1 1ывается следящим устройством, а кривая 3 построена с учетом эквиконцентрационных линий и отражает зависимость гемолитического эффекта сапо нина от концентрации. 944 Построение кривой литической зависимости сапонина от концентрации в координатах Со so °% прямую линию с углом наклона равным 2, что соответствует наклону, полученному по точкам СО, и указьгоает на применимость предлагаемого способа для изучения зависимости литической ак1ТИВНОСТИ веществ от концентрации. Для проведения анализа по предлагаемому способу необходимо 10-15 мин. по способу-прототипу - до 90 мин. Кроме того, отсутствует необходи,мость построения кривой по точкам, так как зависимость концентрация эффект регистрируется непосредственно, что повышает точность анализа. Использование предлагаемого способа определения литической активности веществ обеспечивает по сравнению с известным способом следующие пЕ еимущества: отсутствует необходимость разведения испытуемого вещества до дискретных значений концентраций до начала анализа, что увеличивает производительность труда; непрерывная регистрация зависимости литй-ческой активности веществ от концентрации позволяет исключить построение кривой по точкам, что также увеличивает производительность труда и повьшает точность анализа.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВнести ВЕЩЕСТВ, заключающийся в смешивании клеток постоянной концентрации с лизирующим веществом различной концентрации, определении времени лизиса 50% клеток по изменению оптической плотности, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности измерений и сокращения времени анализа, смешивание клеток с лизирующим веществом проводят з непрерывном потоке, а изменение оптической плотности определяют путем постоянного слежения за точкой 50% лизиса во всем диапазоне концентраций лизирующего вещества.Щ (Л