Способ определения активности классического и альтернативного путей системы комплемента мыши Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 G01N33/53 

Изобретение относится к биотехнологии и экспериментальной медицине, и может быть использовано для определения активности классического и альтернативного путей системы комплемента сыворотки крови мыши.

Система комплемента является частью иммунной системы и состоит из более чем 30 компонентов, которые действуют каскадным механизмом. Эта система играет ключевую роль, как в клиренсе иммунных комплексов, так и в иммунном ответе на инфекционные агенты, чужеродные антигены, опухолевые и вирус-инфицированные клетки. Система комплемента может активироваться тремя путями: классическим, альтернативным и лектиновым.

Классический путь является Са²⁺/Mg²⁺-зависимым каскадом, который в норме активируется при формировании иммунного комплекса (ИК). Компонент С1, первый ферментный комплекс в каскаде, является пентамолекулярным комплексом. Включает одну молекулу C1q и по две молекулы C1r и C1s. С1 комплекс связывается с Fc-фрагментом иммуноглобулинов в составе ИК через C1q и инициирует ферментативный каскад системы комплемента. Как только активируется С1 комплекс, C1s расщепляет компонент С4, приводя к образованию C4b, который затем связывает компонент С2. Иммобилизованный компонент С2 расщепляется при помощи фермента C1s с образованием С3-конвертазы (C4bC2a) классического пути.

Альтернативный путь является Mg²⁺ - зависимым и активируется рядом разнообразных веществ, включающих полисахариды клеточных стенок дрожжей и бактерий, определенные биополимерные материалы. При иммобилизации C3b на поверхности на него садится фактор В, который под действием фермента, фактора D, расщепляется и образуется С3-конвертаза (C3bBb) альтернативного пути.

Лектиновый путь активирует комплемент при помощи маннан-связывающего лектина (МСЛ) и двух ассоциированных с ним сериновых протеаз (МАСП-1 и МАСП-2) (подобно с C1r и C1s в классическом пути активации комплемента). Как и в классическом пути активации комплемента, для лектинового пути также требуются компоненты С2 и С4. Активация лектинового пути приводит к формированию С3-конвертазы, аналогичной с С3-конвертазой классического пути (C4bC2a) [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М.: Мир, 2000. - 592 с.].

Субстратом С3-конвертазы трех путей активации является ключевой компонент комплемента, компонент С3, при гидролизе которого образуется С3а (анафилатоксин) и C3b (опсонин). Присоединяя дополнительно молекулу C3b, С3-конвертаза обретает способность гидролизовать компонент С5, который запускает реакцию формирования мембрано-атакующего комплекса (МАК).

При активации комплемента генерируются биологически активные фрагменты белков С3 и С5 (С3а и С5а - анафилатоксины) и C5b-9 (МАК), которые опосредуют воспалительные активности, включающие лейкоцитарный хемотаксис, активацию макрофагов, нейтрофилов и тромбоцитов, тучных и эндотелиальных клеток, повышение сосудистой проницаемости, цитолиз и тканевое повреждение [SahuA., LambrisJ.D. Complement inhibitors are surget conceptin anti-inflamatory therapeutics // Immunopharmacology - 2000. - V.49. - P. 133-148.].

Избыточная (неконтролируемая) активация системы комплемента является частью патогенеза большого числа воспалительных заболеваний. Патологические эффекты могут быть обусловлены повышенной, продолжительной активацией, например, вызванной присутствием иммунных комплексов (системная красная волчанка и связанные с ней заболевания), а также сниженной экспрессией и функцией различных ингибиторов комплемента, или комбинацией этих двух факторов [Carroll M.V., R.В. Sim R.B. Complement in health and disease // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2011. - V.63, №12. - P. 965-975].

Ишемия и последующая реперфузия органов и тканей наблюдается при таких состояниях как инфаркт миокарда или инсульт. Неконтролируемая активация системы комплемента играет важную роль при реперфузионном повреждении, результатом чего является мультифункциональный воспалительный процесс, вовлекающий генерацию анафилатоксинов, повышенную экспрессию адгезивных белков и тканевых факторов на эндотелиальных клетках и выход из сосудов полиморфно-ядерных лейкоцитов [Banz Y., Rieben R. Role of complement and perspectives for intervention in ischemia-reperfusion damage // Annals of Medicine. - 2012. - V. 44, №3. - P. 205-217].

Для исследования системы комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем: 1) разные разведения исследуемой сыворотки добавляют к эритроцитам барана, сенсибилизированным антителами кролика (ЕА); 2) степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор после центрифугирования. Активность комплемента выражают в гемолитических единицах. За одну гемолитическую единицу комплемента (СН₅₀) принимают такое его количество, которое вызывает гемолиз 50% 0,5 мл стандартной суспензии ЕА при 37°С за 45 мин. В 1 мл сыворотки крови человека содержится 20-40 СН₅₀ [Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник/Меньшиков В.В., Делеторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.: Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. - 368 с.].

Также из уровня техники известен тест определения функциональной активности классического и альтернативного путей системы комплемента, основанный на иммуноферментном анализе (ИФА). Суть теста заключается в определении активности классического пути системы комплемента по сорбции мембрано-атакующего комплекса (МАК) на подложке 96-ти луночной планшеты, сорбированной агрегированными иммуноглобулинами.

Для определения активности альтернативного пути системы комплемента используют плашки с сорбированным липополисахаридом. Связывание МАК проявляют моноклональными антителами, конъюгированными с ферментом, щелочной фосфатазой, с использованием его субстрата. В качестве стандарта используют лиофильно высушенный препарат сыворотки крови человека. Рассчитывают в процентах функциональную активность классического и альтернативного путей активации комплемента относительно стандартной сыворотки [WIESLAB Complement system Classical pathway и WIESLAB Complement system Alternstive pathway "EuroDiagnostica", Швеция].

Существенным недостатком ИФА-теста скрининга комплемента по классическому и альтернативному путям является длительность проведения анализа (не менее 3 часов), использование моноклональных антител, которые делают данный анализ недоступным для рутинных исследований. Также использование лиофильно высушенной сыворотки в качестве стандарта требуют специальных условий для хранения и транспортировки (-20°С), а также подобный стандарт может завышать активность комплемента при анализе из-за потери функциональной активности самого стандарта при лиофилизации, хранении и транспортировке. Самое главное, на рынке отсутствуют коммерческие киты для определения активности комплемента мыши.

Известен способ определения активности классического и альтернативного путей активации комплемента мыши с использованием эритроцитов кролика [Tanaka S., Suzuki Т., Nishioka K. Assay of classical and alternative pathway activities of murine complement using antibody-sensitized rabbit erythrocytes // J. of Immunol. Methods, 1986, V. 86, Р. 161-170]. Суть метода заключается в том, что для определения активности классического и альтернативного путей используют эритроциты кролика, сенсибилизированные антителами морской свинки. Степень лизиса определяют после осаждения нелизированных эритроцитов центрифугированием фотометрическим измерением гемоглобина в супернатанте при 451 нм.

Недостатком данного способа является длительность процедуры, необходимость предварительного приготовление гипериммунной сыворотки морской свинки к эритроцитам кролика, т.е. отсутствие готовых коммерческих антител к эритроцитам кролика, минимальный объем сыворотки для теста составляет 0,3 мл, что представляет большую проблему из-за малого количества крови, получаемых у экспериментальных мышей.

Таким образом, на настоящий момент не существует доступного теста для скрининга функциональной активности системы комплемента мыши.

Техническим результатом предлагаемого способа является разработка тест-системы для определения активности классического и альтернативного путей системы комплемента мыши, а также упрощение регистрации результатов анализа в рутинных исследованиях.

Указанный результат достигается тем, что определение общей активности комплемента проводят с использованием стандартизированных эритроцитов кролика (2,75×10⁸ кл/мл), сенсибилизированных антикроличьими антителами человека (ЕкрАТ), 12,5% сыворотки в условиях вероналового солевого буфера (VBS²⁺) при температуре (37,0±0,5)°С в течение 10 мин. Реакцию комплемент-зависимого лизиса ЕкрАТ оценивают турбидиметрически по снижению оптической плотности суспензии ЕкрАТ при длине волны 620 нм, затем определяют степень лизиса эритроцитов в опытных пробах по калибровочному графику, где контроль ЕкрАТ представляет 0% лизиса, а контроль полного лизиса ЕкрАТ - 100% лизис.

Для определения активности альтернативного пути комплемента мыши используют вероналовый буфер, содержащий 10 мМ ЭГТА и 5 мМ Mg²⁺, инкубируют 30 мин при 37°С и определяют степень лизиса, как описано выше. Активность классического пути системы комплемента мыши рассчитывают как разность между общей активностью и активностью альтернативного пути комплемента мыши. Сравнивают полученные данные в опытных и контрольных группах мышей.

Заявленное изобретение поясняется фигурами:

на фиг. 1 представлен график зависимости оптической плотности суспензии эритроцитов кролика при длине волны 620 нм от концентрации эритроцитов;

на фиг. 2 представлен график для определения степени лизиса эритроцитов кролика в % методом турбидиметрии;

на фиг. 3 представлен график определения оптимальной концентрации антител к Екр для активации комплемента сыворотки крови мыши;

на фиг 4 представлена раститровка пулированной сыворотки крови мышей с эритроцитами кролика, сенсибилизированных анти-Екр антителами человека;

на фиг. 5 представлено влияние времени инкубации на гемолиз эритроцитов кролика;

на фиг. 6 представлены сводные данные общей активности и активности альтернативного и классического путей системы комплемента в сыворотке крови у мышей;

на фиг. 7 представлены данные о влиянии замораживания и хранения проб при -20°С на активность комплемента сыворотки крови мышей.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови, готовят сыворотку, проводят литический тест и осуществляют расчет степени лизиса в опытных пробах. Гемолитический тест проводят с использованием 2,75×10⁸ кл/мл эритроцитов кролика, сенсибилизированных антителами человека [ЕкрАТ] в вероналовом солевом буфере, содержащем Са²⁺ и Mg²⁺ (VBS²⁺). Время проведения скрининг-теста - 10 мин. Суть метода заключается в изменении светорассеивания эритроцитов при их лизисе в 96-ти луночных иммунологических плоскодонных планшетах. Изменение светорассеивания при лизисе эритроцитов определяют турбидиметрически при длине волны 620 нм с использованием фотометра для иммуноферментного анализа. Для определения степени лизиса ЕкрАТ в опытных образцах строят калибровочный график зависимости оптической плотности А₆₂₀ от лизиса эритроцитов кролика по которому определяют степень лизиса (фиг. 2), где за 0% лизиса принимают оптическую плотность контроля ЕкрАТ, на спонтанный лизис, соответственно за 100% лизиса принимают оптическую плотность контроля на полный лизис. Для определения активности альтернативного пути комплемента мыши используют вероналовый буфер, содержащий 10 мМ ЭГТА и 5 мМ Mg²⁺ (VBS-Mg-EGTA), инкубируют 30 мин при 37°С и определяют степень лизиса, как описано выше. Активность классического пути системы комплемента мыши рассчитывают как разность между общей активностью и активностью альтернативного пути комплемента мыши. Сравнивают полученные данные в опытных и контрольных группах мышей.

Определение оптимальной концентрации эритроцитов кролика для определения функциональной активности системы комплемента. Эритроциты кролика 3 раза отмывают в вероналовом солевом буфере (VBS²⁺) центрифугированием в течение 10 мин при 2800 об/мин. Строят график зависимости оптической плотности суспензии ЕкрАТ при длине волны 620 нм от концентрации эритроцитов в процентах. Для этого 4% суспензии Екр прогрессивно разводят в плоскодонной 96-ти луночной иммунологической планшете в объеме 50 мкл VBS²⁺. Объем доводят до 100 мкл тем же буфером. Тщательно перемешивают и измеряют на фотометре для иммуноферментного анализа при А₆₂₀ (фиг. 1).

Как видно из фиг. 1, зависимость оптической плотности суспензии эритроцитов кролика от концентрации их в растворе при А₆₂₀ имеет экспоненциальный характер. Поэтому для теста определения активности системы комплемента нами выбрана концентрация эритроцитов в пределах от 0,125 до 0,5%, т.е. 0,25%, которая в объеме 100 мкл в лунке 96-луночного планшета дает оптическую плотность, равную 0,3, что соответствует 2,75×10⁸ эритроцитов кролика в мл.

Для определения степени лизиса эритроцитов нами предложен калибровочный график (фиг. 2), где степень лизиса эритроцитов оценивают по снижению оптической плотности при длине волны 620 нм. За 0% лизиса принимают оптическую плотность контроля эритроцитов кролика на спонтанный лизис (12,5 мкл 2% Екр + 75 мкл VBS²⁺), соответственно за 100% лизис принимают оптическую плотность контроля на полный лизис (12,5 мкл 2% Екр + 75 мкл H₂O).

Таким образом, калибровочный график позволяет определять методом турбидиметрии степень лизиса эритроцитов кролика в процентах по оптической плотности пробы без стадии центрифугирования и измерения гемоглобина в супернатанте и последующего расчета степени лизиса эритроцитов, что существенно упрощает регистрацию результатов анализа активности системы комплемента в исследованиях. Определение степени лизиса эритроцитов методом турбидиметрии также позволяет проводить кинетические исследования функциональной активности комплемента, т.е. исследования комплемент-опосредованного лизиса эритроцитов во времени без остановки реакции для измерения степени лизиса.

Определение оптимальной концентрации анти-Екр антител человека для активации комплемента по классическому пути. Предварительно инактивированную прогреванием (20 мин при 56°С) сыворотку крови человека, содержащего антитела к Екр, вносят от 2 до 14 мкл в лунки иммунологических планшет с плоским дном, затем добавляют 25 мкл пулированной сыворотки крови от 10 мышей и 12,5 мкл суспензии Екр с концентрацией 2,75×10⁸ кл/мл. Объем инкубируемых проб доводят до 100 мкл буфером VBS²⁺. Тщательно перемешивают, измеряют мутность проб при А₆₂₀ (0 мин) и инкубируют в течение 30 мин при 37°С. В качестве контроля используют: 1 - контроль эритроцитов на спонтанный лизис (12,5 мкл Екр + 87,5 мкл VBS²⁺); 2 - Контроль на полный лизис (12,5 мкл Екр + 87,5 мкл H₂O). Степень лизиса Екр в % определяют по калибровочному графику (фиг. 2), где контроль Екр на спонтанный лизис представляет 0% лизис, а контроль на полный лизис - 100% лизис. Полученные результаты представлены на фиг. 3.

Как видно из фиг. 3, максимальный лизис эритроцитов кролика наблюдается при разведении 1:9 антител человека против Екр. При дальнейшем увеличении сыворотки человека (инактивированной) наблюдается плато и снижение степени лизиса Екр.

Таким образом, нами в дальнейших исследованиях использовано оптимальное разведение в 1:9 исходной термоинактивированной сыворотки человека как источник антител к Екр в тестируемых пробах.

Титрование пулированной сыворотки крови мышей на общую активность системы комплемента методом турбидиметрии.

Предварительно от 5 до 25 мкл пулированной сыворотки крови от 10 мышей вносят в лунки иммунологических планшет с плоским дном, объем в каждой пробе доводят до 87,5 мкл буфером VBS²⁺. Далее вносят по 12,5 мкл 1% суспензии сенсибилизированных эритроцитов кролика (ЕкрАТ) (конечный объем гемолитической системы 100 мкл), тщательно перемешивают и измеряют мутность проб при 620 нм (0 мин) на фотометре для ИФА. Затем инкубируют в течение 30 мин при 37°С. В качестве контроля используют: 1 - контроль эритроцитов на спонтанный лизис (12,5 мкл ЕкрАТ + 87,5 мкл VBS²⁺); 2 - контроль на полный лизис (12,5 ЕкрАТ + 87,5 мкл Н₂О). После инкубации тщательно перемешивают, измеряют мутность проб и определяют степень лизиса эритроцитов в % по калибровочному графику (фиг. 2). Полученные результаты представлены на фиг. 4. Как видно из фиг. 4, степень лизиса от до 80% зависит линейно от концентрации сыворотки в гемолитической системе при инкубации в течение 30 мин.

Как видно из фиг. 4, 50% лизис КкрАТ наблюдается при концентрации пулированной сыворотки мышей равной 12,5 мкл. Поэтому для дальнейших исследований активности комплемента использовали 12,5 мкл сыворотки у индивидуальных мышей в тест-системе, содержащей 0,25% суспензии ЕкрАТ.

Определение оптимального времени инкубации для определения функциональной активности системы комплемента. К 12,5 мкл пулированной сыворотки мышей добавляют 75 мкл буфера VBS²⁺ и 12,5 мкл 2% суспензии ЕкрАТ в лунки 96-ти луночных плоскодонных планшет для иммуноферментного анализа. Тщательно перемешивают и инкубируют в течение 60 минут при 37°С при постоянном перемешивании. В процессе инкубации измеряют оптическую плотность проб на фотометре Multiscan FC с блоком термостатирования и шейкером, при длине волны 620 нм через 0, 10, 20, 30 и 60 мин. В качестве контроля используют контроль ЕкрАТ на спонтанный лизис и контроль на полный лизис как описано выше. Степень лизиса ЕкрАТ в % определяют по калибровочному графику. Полученные результаты представлены на фиг. 5.

Как видно из фиг. 5, максимальный лизис наблюдается в течение 10 мин инкубации в пробах №1, 3, 4 и 5. В пробе сыворотки мыши №2 с исходно низкой активностью комплемента при 10 минутной инкубации, максимальная активность комплемента достигается при инкубации в течение 60 мин, что в принципе не влияет на общую картину по активностям в 5 пробах.

Таким образом, оптимальным временем инкубации данной гемолитической системы является 10-ти минутная инкубация при 37°С.

Примеры осуществления

Пример 1. Определение общей активности системы комплемента в сыворотках крови мышей в разных экспериментальных группах

К 12,5 мкл сыворотки крови мыши добавляют 75 мкл буфера VBS²⁺ и 12,5 мкл 1% ЕкрАТ в лунки 96-ти луночных плоскодонных планшет для иммуноферментного анализа. Тщательно перемешивают и инкубируют в течение 10 минут при 37°С при постоянном перемешивании. Степень лизиса ЕкрАТ в % определяют, как описано выше. Проведены исследования общей активности комплемента в 21 (пробы №1-5 - контрольная группа мышей; пробы №6-10 - опыт 1; пробы №11-15 - опыт 2; пробы №16-21 - опыт 3) пробах сыворотки мышей. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, в пробе №2 практически не определяется активность комплемента при данных концентрациях сыворотки. В остальных пробах контрольной группы среднее значение общей активности комплемента по лизису ЕкрАТ составило 22% (16;24), в опытной группе 1 активность в среднем альтернативного пути комплемента мышей был почти в 2 раза больше и составил 41% (20; 73) лизиса. В опытных группах 3 и 4 общая активность комплемента была почти в 3 раза выше, чем в контрольной группе мышей (опыт 3 - 57%(29;92) и опыт 4 - 63%(33;96).

Таким образом, полученные результаты убедительно подтверждают информативность определения общей активности комплемента у экспериментальных мышей в зависимости от групп. Самая низкая активность определяется в контрольной (интактной) группе мышей. Более высокая активность в опытных группах свидетельствует о наличии разной степени воспалительной реакции в организме животных.

Пример 2. Определение активности альтернативного пути системы комплемента в сыворотках крови мышей

К 12,5 мкл сыворотки крови мыши добавляют 75 мкл буфера VBS-Mg-EGTA и 12,5 мкл 1% ЕкрАТ, суспендированных в буфере VBS-Mg-EGTA, в лунки 96-ти луночных плоскодонных планшет для иммуноферментного анализа. Тщательно перемешивают и инкубируют в течение 30 минут при 37°С при постоянном перемешивании. Степень лизиса ЕкрАТ в % определяют, как описано выше. Проведены исследования активности альтернативного пути комплемента в тех же пробах сыворотки мышей, что в примере 1. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, в пробе №2 практически не определяется активность альтернативного пути комплемента мыши при данных концентрациях сыворотки. В остальных пробах контрольной группы среднее значение общей активности комплемента по лизису ЕкрАТ составило 8% (5; 10), в опытной группе 1 активность в среднем альтернативного пути комплемента мышей был почти на 50% выше, чем в контрольной группе и составил 12% (8; 19) лизиса. В опытных группах 3 и 4 активность альтернативного пути комплемента был более чем в 2 раза выше, чем в контрольной группе мышей (опыт 3 - 22%(10;45) и опыт 4 - 20%(7;42).

Таким образом, полученные результаты убедительно подтверждают информативность определения альтернативного пути комплемента у экспериментальных мышей в зависимости от групп. Самая низкая активность определяется в контрольной (интактной) группе мышей. Более высокая активность в опытных группах свидетельствует о наличии разной степени воспалительной реакции в организме животных.

Пример 3. Определение активности классического пути комплемента в сыворотке крови мышей

Учитывая то, что определение общей активности комплемента в сыворотке крови мышей включает активацию как альтернативного, так и классического путей системы комплемента, нами был рассчитана активность классического пути комплемента мышей как разность между общей активностью комплемента и активностью альтернативного пути комплемента мышей. Полученные результаты представлены на фиг. 6.

Как видно из фиг. 6, в контрольной группе мышей общая активность комплемента чуть более 50% обусловлена активностью классического пути комплемента в тесте лизиса эритроцитов кролика, сенсибилизированных анти-Екр антителами человека. В опытных группах наблюдается повышение доли классического пути комплемента мышей в общей активности системы комплемента.

Таким образом, повышенная активность комплемента в опытных группах обусловлена повышенной активностью классического пути комплемента мышек.

Пример 4. Влияние замораживания и хранения проб при -20°С на активность комплемента сыворотки крови мышей

После приготовления сыворотки крови мышей, пробы были разлиты по 50 мкл в пробирки типа «эппендорф» и заморожены при -20°С и хранились в течение 2 недель. После размораживания определяли общую активность комплемента и активность альтернативного пути комплемента, рассчитывали активность классического пути комплемента как описано выше. Полученные результаты представлены на фиг. 7.

Как видно из фиг. 7, общая активность комплемента сыворотки крови мышей составила в среднем 64% (14; 100), активность альтернативного пути составила в среднем 25%(4; 54) и активность классического пути, соответственно - 39% (6;90).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что замораживание в объеме 50 мкл при -20°С практически не влияет на активность системы комплемента мышей.

Таким образом, предлагаемый способ определения общей активности системы комплемента и активности альтернативного пути комплемента мыши при стандартных условиях (концентрация сыворотки - 12,5%, концентрация эритроцитов кролика равная 2,75×10⁸ клеток в пробе (А620=0,3 ОЕ) позволяют рассчитывать активность классического пути комплемента в сыворотке крови мышей как разность между общей активностью комплемента и активностью альтернативного пути комплемента мыши.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения активности классического и альтернативного путей комплемента в сыворотке крови мышей, включающий проведение реакции лизиса 0,25% суспензии эритроцитов кролика, сенсибилизированных антителами человека (ЕкрАТ), 12,5% сывороткой крови мышей при 37,0±0,5°С, построение калибровочного графика зависимости оптической плотности А₆₂₀ суспензии от лизиса эритроцитов кролика, по которому определяют степень лизиса ЕкрАТ. Общую активность комплемента определяют в условиях VBS²⁺ и инкубируют в течение 10 мин, активность альтернативного пути комплемента определяют при тех же соотношениях в гемолитической системе только в условиях VBS-Mg²⁺-EGT и 30-ти мин инкубации; активность классического пути комплемента мышей определяют как разность между общей активностью комплемента и активностью альтернативного пути комплемента. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов исследования комплемент-опосредованного лизиса эритроцитов во времени. 7 ил., 2 табл., 4 пр.

Способ определения активности классического и альтернативного путей комплемента в сыворотке крови мышей путем проведения реакции лизиса эритроцитов кролика, сенсибилизированных антителами, сывороткой крови мышей, построения калибровочного графика зависимости оптической плотности А₆₂₀ суспензии от лизиса эритроцитов кролика, по которому определяют степень лизиса эритроцитов, отличающийся тем, что используют эритроциты кролика, сенсибилизированные антителами человека (ЕкрАТ), 12,5% сыворотку крови мышей, 0,25% суспензию ЕкрАТ при температуре 37,0±0,5°С, при этом общую активность комплемента определяют в условиях VBS²⁺ и инкубируют в течение 10 мин, активность альтернативного пути комплемента определяют при тех же соотношениях в гемолитической системе, только в условиях VBS-Mg²⁺-EGT и 30-ти мин инкубации; степень лизиса ЕкрАТ оценивают по калибровочному графику, активность классического пути комплемента мышей определяют как разность между общей активностью комплемента и активностью альтернативного пути комплемента.