Способ получения иммуносупрессивного фактора Советский патент 1984 года по МПК A61K35/26 

эо

ZfS Од Ч Изобретение относится к медицине -и 1сасается способа получения иммуносупрессивного фактора. Известен способ получения иммуносупрессивного фактора с использова,нием органов дивотных .1j . Известен также способ получения иммуносупрессивного фактора путем экстракции гомогената тимуса и селезенки телят, с последующим отделе- нием надосадочной жидкости центрифугированием, фильтрованием и вьщелением целевого продукта 2j . Однако известные способы не обеспечивают получение.целевого продукта с широким спектром иммуносупрессивного Действия. Цель изобретения - расширение спе тра иммуносзшрессивного действия целевого продукта. Эта цель достигается тем, что согласно способу получения иммуносупре сивного фактора путем экстракции гом гената исходной ткани с последующим отделением надосадочной жидкости цвн рифугированием, фильтрованием и вьще лением целевого продукта, в качестве исходной ткани используют лимфатичес кие узлы морской свинки, центрифугирование проводят непосредственно поеле экстракции, фильтрат диализуют через полупроницаемую мембрану против дистиллированной воды, далее диализат концентрируют, фракционирую его на колонке с сефадексом -15 и отбирают фракции с молекулярной массой 100-500 дальтон. Пример. 5г ткани лимфатичес ких узлов морских свинок гомогенизируют с помощью микроизмельчителя- тка ней РТ-2 (5000 об/мин, 5 -шн), экстр гируют 24 ч при +4с (на 1 часть тка ни - 10 частей 1,14 М раствора NaCl рН 7,2) и затем центрифугируют со ск ростью 15000 об/мин в течение 30 мин при + . Надосадочную жидкость фил труют через фильтровальную бумагу и диализирзгют через полупроницаемую ме брану (почечный целлофан) против 10 объемов дистиллированной воды (рН 7, 2) в течение 24 ч. Диализат концентриру ют выветриванием в целлофановых куль ках под вентилятором при + 4С{О объема 10 мл. Концентрированный диал зат экстракта лимфатических узлов морских свинок подвергают фракционированию на хроматографической колонке 2x100 см, заполненной сефадексом С-15 и стабилизированной О,14 М раствором NaGl рН 7,2. Характерный профиль кривой элюции регистрируют на спектрофотометре СФ-16 при длине волны 280 нм. Собирают фракцию, выходящую из колонки в объеме элюиции 500-600 мл, идентифицируют по спектру поглощения в УФ-области (максимальное поглощение в области 200-210, 230-240 и 270-280 нм) и концентрируют вьшетриванием в целлофановых кульках в 10 раз. С целью определения молекулярной массы вьщеленного вещества на ту же колонку наносят вещества с известной молекулярной массой, в данном случае АТФ (молекулярная масса (551,15) и аминокислоту валян (молекулярная масса 117,15). Данное вещество выходит из колонки в объеме элюции позднее АТФ, но раньше валина, т.е. его молекулярная масса менее 500, но более 100 дальтон. Супрессивную дозу фактора вводят мьппам линии СВА подкожно, одновременно с внутрибрюшинным введением взвеси эритроциров барана в 0,14 М растворе NaCl в дозе 2x10 клеток. У животных определяют содержание Т- и В-лимфоцитов в тимусе, селезенке и лимфатических узлах, количество антителообразующих клеток в селезенке, блисттрансформирующую способность Т-лимфоцитов с ФГА и титры агглютининов и гемолизинов в сыворотке крови. Кроме того, определяются сроки жизни кожного аллотрансплантата под влиянием вьщеленного фактора. I. В табл. 1 показано влияние введения иммуносупрессивного фактора лимфатических узлов морских свинок на показатели клеточного и гумморального иммунитета у мьшей линии СВА. Полученный препарат проявляет выраженный иммуносупрёссивный эффект на некоторые показатели клеточного (снижение содержания Т- и В-лимфОцитов в лимфоидных органах, угнетение бласттрансформирующей способности Т-лимфоцитов) и гуморального иммунного ответа (снижение титров аглютининов и гемолизинов в сыворотке крови) у мьшей, т.е. его иммуносупрёссивный эффект более выражен по сравнению с прототипом и распространяется на Т- и В-системы иммунитета.

3 .1118367 ,4

В то же время вьщеленный фактор не Эффективность использования нм 4yоказывает влияния на содержание анти-носупрессивного фактора, полученного

телообразующих.клеток в селезенкепо предлагаемому-способу из лимфои не изменяет продолжительнЬсть жиз-узлов морской свинки в сравнении с

ни кожного аллотрансплантата у мы- прототипом доказывается примерами

шей (табл. 1).чтабл. 2.

Таблица.1;

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСУ- , ПРЕССИВНОГО ФАКТОРА путем экстракции томогената исходной ткани с последующим отделением надосадочной жидкости центрифугиро ванием, фильтрованием : и вьщелением целевого продукта, о тл и ч a ю щ и и с я тем, что, с целью расширения спектра иммуносупрессивного действия целевого продукта, в качестве исходной ткани используют лимфатические узлы морской свинки, центрифугирование проводят непосредственно после экстракции,, фильтрат диализируют через полупроницаемую мембрану против дистш1лирс |ванной воды, далее диализат концентрирует, фракционируют его на колонке с сефадексом -15 и отбирают фракции с молеку-( лярной массой дальтон. ,