Способ определения пиридоксаля и пиридоксаль-5-фосфата при их совместном присутствии в растворе Советский патент 1984 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к биохимии преимущественно аналитической и кли нической, и может быть использовано .в энзимологии и медицине. Пиридоксаль-5 -фосфат (ПЛФ) явля ется основной коферментной формой витамина В. В биологическом матери ле помимо ПЛФ всегда имеются и другие соединения группы витамина Б, в особенности пиридоксаль (ШП. Правильная картина состояния обмена витамина В, может быть получена, если определяется не только количес во самого ПЛФ, но и Ш1, а также их суммарное содержание. Существующие микробиологические и энзиматические способы определения ПЛФ не позволяют проводить такой полный анализ. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является флуоресцен ный метод определения ПЛФ и Ш1, основанный на получении фотоустойчивы антранилатных производных. По зтому методу анализируемую пробу обрабаты вают метилантранилатом в абсолютном метаноле, нагревают, добавляют восстановитель, снова нагревают, подкисляют раствором нее в метаноле, удаляют растворитель в вакууме, рас творяют в воде, подщелачивают, многократно извлекают водный раствор хлористьм метиленом. Антранилатное производное ПЛ находится в органической фазе и его определяют после очистки на колонке с силикагелем и препаративной тонкослойной хроматографии. Для определения ЕШФ водную фазу - обрабатывают щелочной фосфатазой, после чего необходимое производное выделяют хроматографией и из меряют интенсивность флуоресценции растворов антранилатных производных Cl . Недостатками данного метода явля ются многоетадийность и необходимость выделения, очистки и разделения производных Ш1 и ПЛФ. Цель изобретения - упрощение спо соба определения Ш1 и Ш1Ф при их совместном присутствии в растворе. Поставленная цель достигается тем, что согласно предлагаемому способу анализируемую пробу обрабатывают раствором 0-метилгидроксиломина в .Ма ацетатном буфере с рН 4-5 до концентрации 0-метилгидрокси ; амина в пробе , раствор инкуби руют, доводят рН до 6-7, измеряют интенсивность флуоресценции с последующим добавлением 0-метилгидроксиламина до концентрации 10 М, доведением рН до 4-5, инкубированием раствора, доведением рН до 6-7, измерением интенсивности флуоресценции и расчетом по формуле. На чертеже показана кинетика убыли исходного продукта (-ciJ в реакции 0-метилгидроксиламина с пиридоксалем и пиридоксаль-5 -фосфатом в 0,1 М Na-ацетатном буфере при рН 5,0 и температуре 25°С; реакция при постоянной концентрации 0-метилгидроксиламина 10 М и концентрации ПЛ и ПЛФ, равных: - 10В основе предлагаемого способа лежит свойство ПЛФ образовывать 0метилоксим с большей скоростью, чем ПЛ при прочих равных условиях. На первом этапе в оксим переводится весь присутствующий в растворе ПЛФ и только часть ПЛ. Скорость преобразования ППФ ( концентрации 4 ЮМ) в соответствующий оксим при избытке концентрации 0-метилгидроксиламина ( ОМГА J в растворе (на порядок или более по сравнению с концентрацией ПЛФ )зависит только от концентрации реагента. Это проиллюстрировано на чертеже (кривая ПЛФ}, где показана кинетика убыли исходного продукта при концентрации ОМГА М и концентрациях ПЛФ в пределах . Концентрация реагента М подобрана так, чтобы примерно через 40-50 мин, когда весь ПЛФ преобразуется в соответствукхций оксим, аналогичная реакция преобразования ПЛ происходила заведомо менее чем на 10%. На втором зтапе в оксим переводится оставшаяся в растворе часть ПЛ. Для этого концентрация реагента повышается до . При такой концентрации полное преобразование ПЛ в его оксим завершается примерно через 30-40 мин. Повьшение концентрации в зтом случае ускоряет реакцию ОМГА с Ш1, причем дальнейшее увеличение концентрации на порядок () дополнительно сокращает время реакции примерно в 5 раз. Способ осуществляют следующим образом. к исследуемому раствору сначала добавляют такое количество 0-метилгидроксиламина, чтобы концентрация его в исследуемом образце была поряд и через определенное время производят измерение интенсивности суммарной флуоресценции (Зд ) при рН 6-7, в которую вносит вклад свечение 0-метилоксима ПЛФ (З-,), а также свечение 0-метилоксима ПЛ ( образовавшегося в результате частичной трансформации ПЛ. Таким обра S 3 - 2 Г где ci - доля трансформированного ПЛ, определяемая из графика на черте же. Затем при рН 4-5 доводят концентрацию 0-мётилгидроксиламина до величины порядка 10 М и спустя определенное время при рН 6-7 снова производят измерение интенсивности суммарной флуоресценции { с 1 которая равна: , i Решая совместно уравнения ( 1 и (2 находят величины 3 и Jj и, сравни вая их С- соответствующими калибровочными графиками для 0-метштоксимов Ш1 и Ш1Ф, определяют концентрации ПЛ и ПЛФ. Этим методом определяются Ш1 и ПЛФ в концентрациях до 10 М включительно при соотнощении сигнал шум 8:1. Построение калибровочных графиков Готовят ряд растворов с заданными концентрациями Ш1 или ПЛФ в Na-ацетатном буфере с рН 4-5, например растворы с концентрациями, М: 1,03 idv-1 i} j|jDi 1 1чиоцсп1 улцппми, rii 1 3,ЫО 1,03. 3,1 1, 3,1-10 Затем в каждом растворе проводят реакцию с 0-метилгидроксиламином для получения соответствующих оксимов. Для этого берут 2,9 мл приготовлейных растворов Ш1 или ПЛФ соответствующих концентраций и добавляют 0,1 мл 0,3 М раствора 0-метилгидроксиламина. При этом получающиеся в результате разведения концентрации оксимов соответственно равны, М:. , 10 3. а концентрация 0-метилгидроксиламина в кювете . Реакщпо проводят в темноте при 25С. Спустя мин доводят рН раствора до 6-7 и измеряют интенсивность флуоресценции при 450 нм и длине волны возбуждающего света 370 нм. , Пол ученные данные fic014пользуют для построения калибровочных графиков. Все растворы готовят на деионизированной воде. Используют ацетат натрия и гидроксид натрия марки ОСЧ, уксусную и соляную кислоты, дополнительно перегоняют, хлоргидрат 0-метилгидроксиламина дважды перекристаллизовывают,. Пример 1. Готовят раствор, содержащий 610М ПЛФ и ПП. Для приготовления такого раствора делают маточные .растворы пиридрксаля и пиридоксаль-5 -фосфата с концентрацией , из которых сначала разведением получают рабочие растворы с концентрацией веществ , а затем испытываемые. Приготовление маточного раствора пиридоксаля. ПИридоксаль гидрохлорид, ,5, Навеску пиридоксаля 20,4 мг помещают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем до 100 мл деионизированной водой. Приготовление маточного раствора пиридоксаль-5 -фосфата. Пирндрксалъ-5-фосфат (кислота), ,17. Навеску 26,5 мг помещают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят .объем до 100 мл деионизированной водой. . Приготовление рабочих растворов пиридоксаля и пиридоксаль-5 -фосфа та (концентрация ). I мл маточного раствора пиридоксаля или пиридоксаль-5 -фосфата пли (.:. , мещают в мерную колбу емкостью 100мл и доводят до 100 мл 0,1 М ,На-ацетатным буфером с рН 5,О. Приготовление испытываемого раствора. , В мерную колбу емкостью 100 мл вносят 6 мл раствора пиридоксаль-5 фосфата концентрации и 0,6 мл раствора пиридоксаля концентрации также (рабочие растворы). Объем доводят до 10 мл 0,1 М Naацетатным буфером с рН 5,0. Приготовление маточного раствора О-метилгидроксиламина концентрации 3-10- М. 0-Метилгидроксиламин, МВ«83,5. Навеску 250,5 мг помещают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем до 00 мл 0,1 М Na-ацетатным буфером с рН 4-5. 5 Определение содержания пиридоксаля и пиридоксаль-5-фосфата в испытьшаемом растворе. 3 мл испытываемого раствора понецают в кювету и добавляют в него 10 мкл раствора 0-метил гидг роксиламина в О, М. Na-ацетатном буфере с рН А-5, Раствор инкубируют в темноте в течение 40-50 мин при , Затем доводят рН раствора до 6-7 и измеряют суммарную интенсивность флуоресценции при 450 нм и длине волны возбуждающего света 370 нм Д35),в которую вносит вклад свечение 0-метилоксима Ш1Ф J, а также свечениеО-метилоксима ПЛ -Л образовавшегося в результате частичной трансформации ПЛ, т.е.: Л 12Ч где ti доля трансформированного ПП, определяемая из графика (кинет ка убьти относительной концентрации ПЛ U- ct) во времени, кривая ПЛ). Через 50 мин(из графика) оС 0,0 Затем повышают концентрацию 0меткпгидроксиламина в кювете до 10 М добавлением в кювету 2,5 мг О-метилгидроксиламина, доводят рН раствора до 4-5, инкубируют в, темноте в течение 30-40 мин при . Через 30-40 мин доводят рН анализируемой пробы до 6-7 и измеряют сум марную интенсивность флуоресценции S, при 450 нм и длине волны возбуадения 370 нм: результате получают систему и двух уравнений с двумя неизвестным решая которую, находят: л,. Величины и Jg измеряют, зна чения вС и lr«f находят из приве 16 денного на чертеже графика (кривая Ш1). По величине 3 из калибровочного графика для ПЛФ находят его концентрацию, а по величине J из калибровочного графика для ПЛ находят концентрацию ПЛ. Испытьшаемый раствор готовят три раза. Результаты испытаний приведены в табл.1. Значение d определяют по графику (см.чертеж): af 0,065; l-oC 0,935. Концентрацию пиридоксаля и пиридоксаль-5 -фосфата определяют по. калибровочным графикам. Пример 2. Готовят раствор, содержащий 6-10 М Ш1Ф и 6-10 М ПЛ. Маточные и рабочие растворы готовят аналогично примеру 1. Приготовление испытьшаемого раствора. В мерную колбу емкостью 100 мл вносят 0,6 мл раствора пиридоксаль5-фосфата концентрации и 6 мл раствора пиридоксаля концентрации bf (рабочие растворы}. Объем доводят до 100 мл 0,1 М Na-ацетатным буфером с рН 5,0. Определение содержания пиридоксаля и пиридоксаль-5 -фосфата в испытываемом растворе. 3 мл испытываемого раствора помещают в кювету и добавляют в него 10 мкл 3LO M раствора О-метилгидроксиламина в 0,1 М Na-ацётатном буфере с рН 5,0. Далее повторяют все процедуры, описанные в соответствующем пункте примера 1. Результаты испытаний приведены в табл.2. Значения d определяют из графика на чертеже (аС 0,065; l-ot 0,935 ). Концентрации пиридоксаля и пиридоксаль-5 -фосфата определяют по калибровочным графикам. Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным является более простым и быстрым и позволяет надежно определять с точностью до 10% концентрации 1Ш и ПЛФ М.

Таблица 1

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРДЦОКСАЛЯ И Ш1РИДОКСАЛЬ-5 -ФОСФАТА ПРИ toJO ИХ СОВМЕСТНОМ ПРИСУТСТВИИ В РАСТВОРЕ с использованием обработки анализируемой пробы химическим реагентом и измерением интенсивности флуоресценции образующегося соединения, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, анализируемую пробу обрабатывают раствором 0-метилгидроксиламина в Ma-ацетатном буфере с рН 4-5 до концентрации 0-метилгидроксиламина в пробе , раствор инкубируют, доводит рН до 6-7, измеряют интенсивность флуоресценции с последующим добавлением 0-метилгвдроксиламина до концентрации , доведением рН до 4-5, ин-, 9 кубированием раствора, доведением рН до 6-7, измерением интенсивности флуоресценции и расчетом по формуле. ал 00 со

Примечание: С,,д 5,7 М/л;

С„(5,87±0,12МО М/л

I5,95t0,l0)tl0 М/л

ПА С„., (5,9910,05 МО М/л.

ПАф

Таблица 2