Штамм перевиваемых клеток @ -кд,используемый для вирусологических исследований Советский патент 1984 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к медицинс кой вирусологии и представляет собой клоновьй вариант клеток эпидермоидной карциномы шейки матки человека для вирусологических исследований. Известен штамм перевиваемьгх клеток HeLa, происходящий от клеток эпидермоидной карциномы шейки матки человека lj . Однако этот штамм, в силу того, что его культивировали в различных лабораториях при.различных режимах и .в различных по составу питательных средах, стал вариабельным по культуральной, морфологической, вирусологической и кариотипической характеристикам. Целью изобретения является отбор штамма перевиваемь1х клеток HeLa, отличающийся стабильностью своих культур ал ьных, морфологическ.их, вирусологических, и.кариотипических характеристик. Эта цель достигается использованием штамма HeLa-КД, представляющег собой клоновый вариант клеток эпидермоидной карциномы шейки матки человека. Штамм HeLa-КД получен путем одно кратного клонирования линии клеток эпидермоидной карциономы шейки матки человека по Паку и последующего двукратного клонирования по У Миню в модификации Угрюмова, хранится в коллекции клеточных культур Свердловского НИИВИ под № 110-13. Морфологические признаки. Популяция клеток HeLa-КД характеризуется однородными.клетками полигональной формы с отчетливыми светлыми границами, мелкозернистой Щ1топлазмой и овально-круглым ядром с 2-4 м кими ядрышками неправильной формы. Культура в своем составе имеет незн чительную долю аномальньк интерфазньгх клеток 0,7 + 0,3% и аберрантных форм митоза 3,8 + 0,5%, характерным для клоновой линии клеток HeLa-КД является ограничение полиплоидности .с четким вьщелением модального клас са: 50,2 ± 1,8% клеток содержат 6165 хромосом. Физиологические признаки. Клетки НеЬа-КД снимают со стекла раствором Версена щадящим способом, без центр фугирования, ресуспендируют и рассе вают в культуральные матрасы в дозе 50 тыс./мл или в пробирки по 120 тыс./мл. Пересевы осуществляют через 5-6 дн роста. Среда роста состоит из равных объемов среды 199 и среды Игла с добавлением 10% нативной сыворотки крови молодняка крупного рогатого скота и антибиотиков (пенициллин 100 ед/мл, стептомицин 50 ед/мл, рН 7,2-7,4. Клоновая линия HeLa-КД отличается стабильной и более выраженной чувствительностью к респираторным и энтеральным вирусам (полио-, ECHO, Коксаки). Цитопатический эффект под влиянием аденовирусов проявлялся в виде набухания.и округления клеток с образованием гроздьев1вдньпс скоплений клеток. Начиная с 24 ч после заражения размеры ядер и ядрышек увеличиваются, в ядрах появляются базрфильные пикнотические включения, которые постепенно заполняют все ядро. Процесс дегенерации клеток HeLa-КД под воздействием аденовируса .заканчивается в течение 48-72 ч. Данные иммунофлуоресцентного анализа выявили максимальное накопление вирусспецифического антигена через 36-48 ч. Титр аденовируса в зараженной культуре 4,55,33 -Ig ТЦП,5()/д4д. Инфицирование кле-. ток HeLa-КД респираторно-синцитиальным ви15усом штамма Лонг вызывает образование симпластов через 2436 ч. Полная деструкция монослоя наступает через 72-96 ч после внесения вируса. Инфекционный титр вируса составляет 4,5-5,5 Ig ТПЦуо;. Содержание вирусного антигена взараженных клетках соответствует инфекционному титру вируса. Инфекционный титр вирусов Коксаки В 1, ВЗ, В5 на югетках ,HeLa-KД составляет 4,5-5,75 Ig , поливирусов I, 11 и III типов 5,57,0 Ig . Данная клеточная культура может быть использована при необходимости в.ьщеления вирусов из материалов от больных при диагностике вирусных инфекций. Для культивирования клеток исполь зуется смесь равных количеств средь 199 и среды Игла с 10% нативнрй сыворотки крови молодняка крупного рогатого скота. Доза клеток при посеве в культуральные матрасы составляет 50 тыс./мл, в пробирки 120 тыс./мл. Пересев осуществляют через 5-7 сут роста.

3

в табл. 1 даны результаты использования клоновой линии перевиваемых клеток HeLa-КД для получения антигенов вирусов; в табл. 2 - то же, для изучения репродукции аденовируса типа 7 ин витро} в табл. 3 то же, для изучения репродукции респираторно-синцитиальног.о вируса штамма Лонг, в табл. 4 - то же, для оценки динамики накопления специфического антигена в клетках (в процентах) по данным иммунофлуоресцентного анализа; в табл. 5 то же, для изучения некоторых показателей матотйческого режима популяции на примере аценовируса типа 7 (доза заражения 0,1 ТЦЦспд д)..

Клетки HeLa-КД хранят в замороженном состоянии.

Режим замораз|сивания: клетки разливают по ампулам в концентрации 1-3 млн. в 1 мл. В качестве консервирующей среды используют росто22692 .4

вую среду с 10% стерильного глицерина . Запаянные ампулы вьщерживают в течение 2-3 ч в рефрижераторе, затем замораживают с помощью аппарата АХК-4 со скоростью 0,5 С/мтлн от О до -20°С, 4°СДшн до , Ю С/мин до , с последующим погружением в сосуды Дьюара с жидким азотом.

восстановления: ампулы с

to клетками после извлечения из азота помещают в водяную баню с температурой +38 С. Размороженные клетки тотчас помещают в культуральные матрасы объемом 250 мл в 30 мл сре15ды роста с 10% сьшоротки. Со 2-3 пассажа клетки приобретают способность формировать плотный монослой. Культура может быть использована в вирусологических исследовани20 .ях и при выделении вирусов из материалов больных в диагностической

ВИруСОЛОГШ ..

Таблица 1

Штамм перевиваемых клеток HeLa-КД № 11083 (коллекция клеточных .культур Свердловского научно-исследовательского института вирусных инфекций), используемый для вирусологических исследований.

5,33 +0,5

HeLa-КД

Специфический через 48-72 ч

3,5 i 0,5

С элементами неспецифики за счет.раннего подползания монослоя 36-72 ч

Таблица 2

Более 95% полных вирусных частиц

Присутствие во взвеси до 10% частиц микоплазм Титр вируса, Ig Клеточная культура

А,5 + 0,5

НеЬа-КД 3,0+0,5

HeLa-исходная

Специфическая через 72-96 ч

С элементами неспецифики за счет более раннего подползания монослоя через 4872 ч

Таблица А

Таблица 5

16,3+3,0

8,0±0,8

7,0±0,8

6,0+0,4

11,0+1,7

12,0+0,8

7,0+1,2 Таблица 3 Характер дегенераТЦДИ/ОЛ ллл ции Примечание:

Продолжение табл.5 Исходная линия клеток HeLa для изучения показателей митотического режима является непригодной из-за вьфаженной патологии интерфазных и делящихся клеток.