Способ получения конъюгированных антигенов Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к иммунохимии, конкретно к способу получения конъюгированных антигенов (полициклический ароматический углеводород - антигенный носитель), которые могут найти применение в медицине и биологии для получения антител к канцерогенным полициклическим ароматическим угле вод орода.м, нейтрализация канцерогенного действия углеводородов и для определения их концентрации и локализации в жидкостях и тканях организма.

Известны способы получения конъюгитов белков и низкомолекулярных веществ-гаптенов, в которых два компонента соединены через диазосвязь 1.

Однако способ характеризуется недостаточно прочной связью при конъюгации полициклических ароматических углеводородов.

Наиболее близким по технической сущностч и достигаемому положительному эффекту к изобретению является способ получения конъюгированных антигенов путем модификации полициклически.х ароматических углеводородов с последующим взаимодействием модифицированных углеводородов с сывороточным альбумином при рН 7- 8 в водно-диоксановой среде при весовом соотнощении соответственно (0,1-0,35):. .В качестве модифицированных производных полициклических ароматических углеводородов используют их изоцианатные производные. Модификацию ароматических углеводородов проводят следующим образом. Для введения реакционноспособной группы углеводороды нитруют избытком концентрированной азотной кислоты, полученное нитропроизводное очищают перекристаллизацией из смеси бензол-лигроин и затем воесганавливают водородом или хлоридом олова в концентрированной соляной кислоте до соответствующих аминопроизводных. Аминопроизводные углеводородов очищают экстракцией из аммиачного раствора бензолом и кристаллизацией из лигроина. Далее аминопроизводные растворяют в бензоле и обрабатывают 10-16-кратным избытком фосгена в толуоле. После упаривания растворителей получают, реационноспособные изоцианатные производные углеводородов, Очистку полученных конъюгированных антигенов обычно производят повторным переосаждением сульфатом аммония или ацетоном с последующим диализом.

Недостатком этого способа получени конъюгированных антигенов является дли тельность и трудоемкость процесса. Реакционноспособное производное углеводородов получают в несколько стадий.. Кроме того, в способе необходима очистка промежуточных производных, применение в ходе синтеза большого количества растворителей, концент рироваиных кислот и токсичных веществ (фосген).

Целью изобретения является упрощение процесса,

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения конъюгированных антигенов путем модификации юлициклических ароматических углеводородов с последующим взаимодействием модифицированных углеводородов с сывороточным альбумином при рН 7-8 в водно-диоксановой среде, модификацию полициклическйх ароматических углеводородов проводят обра боткой надкислотами, а общее массовое соотношение полициклического ароматического углеводорода, надкислоты и альбумина составляет 1:(0,6-4):(1-3).

В качестве полициклических ароматичес-. ких углеводородов используют бензпирен или 3-метилхолантрен.

Способ осуществляется следующим образом.

Реакционноспособное производное угле.водородов получают в одну стадию их инкубированием с избытком надкислоты в диоксане при О-25°С в течение 24 ч в темноте. Далее реакционнОспособное производное углеводородов без стадии выделения добавляют по каплям к перемешиваемому раствору белка в фосфатном буфере при рН 7-8. Смесь перемешивают 24 ч при О-25°С. Полученный конъюгированный антиген отделяют от низкомолекулярных примесей гельфильтрацией на сефадексах. Содержание углеводородов в конъюгатах определяют спектрофотометрически по интенсивности поглощения в области 30000-24000 см сравнением экстинкции эталонных растворов углеводородов с экстинкцией растворов полученных конъюгатов. В зависимости от соотношения реакционноспособного производного углеводорода и белкового носителя, . введенных в реакцию, получают конъюгированные антигены, содержащие от 2 до 20 молекул углеводорода на молекулу носителя.

В предлагаемом способе по сравнению с известным упроще.на технология (проведение реакции в две стадии вместо четырех без очистки и выделения промежуточных продуктов, исключение целого ряда реагентов и растворителей, убыстрение процесса в 3 раза) за счет использования другого приема активирования (введения реакционноспособной группы углеводорода для конъюгирования с белком), а также установления режима осуществления процесса. Соотношение реакционноспособного производного углеводорода и белка 1:(1-3) в реакции конъюгирования выбрано в таких пределах, при KOTOpbix получают конъюгированный антиген оптимального качества, т. е. содержащий от 2 до 20 моль углеводорода на 1 моль белка. При меньшем количестве углеводорода в конъюгате ухудшаются его антигенные свойства, при замещении большем, чем 20 моль углеводорода на моль белка,

1. СПСЮОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ путем модификации полнциклических ароматических углеводородов с последующим взаимодействием модифицированных углеводородов с сывороточным альбумином при рН 7-8 в во/хно-диоксановой среде, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, модификацию полициклических ароматических углеводородов проводят обработкой надкислотами, а общее массовое соотношение полициклического ароматического углеводорода, надкислоты и альбумина составляет Г: