Штамм плесневого гриба @ @ F-154-продуцент гуанилрибонуклеазы Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 C12N9/22 C12R1/66 

Изобретение относится- к микробиологической и химической промышленности и представляет собой штамм, который может быть использован для получения фермента гуанилрибоНуклеазы. . - .

Рибонуклеазы получили широкое применение при расшифровке первичной структуры РНК, удалении РНК из различных препаратов, получении олигонуклеотидов и нуклеотидов из РНК. Ведутся исследования по ферментному синтезу олигонуклеотидов с заданной последовательностью звеньев при помощи рибонуклеаз и по испольэованию РНКаз для лечения ряда вирусных и опухолевых заболеваний. Рибонуклеазы являются также удобными моделями для изучения зависимости между структурой и функцией ферментов.

В качестве основных продуцентов гуанилрибонуклеазы используются грибы родов AspergiKPus, Fusarium, PeniciIlium, Menrospora и др. Q .

Гриб Aspergi2Jus clavatus вьщеляет в питательную среду гуанилспецифичесЙую рибонуклеазу. Однако продуктивность культуры низкая: до 30 ед/мл при определении активности по модифизированному методу Анфинсена и др. или 6270 ед/мл при определении активности по методу фирмы Worthingtom 2j

Наиболее близким по технической сущности и достигаемой цели к предлагаемому штамму является актиномицет Actinomyces aureoverticiffatus, активно синтезирующий гуанилрибонуклеазу З с активностью 25-30 тыс ед/мл, определенной по методу Татарской Р.И. и др., и длительностью хранения без пересева Г-2 мес.

Недостатком этой культуры

является значительная нестабильность

ЧТО заставляет для сохранения активности проводить непрерывную селекцию Это недопустимо удорожает производство гуанилрибонуклеазы и не гарантирует стабильности свойств получаемого продукта.

Целью изобретения является получение нового штамма, обладающего повышенной продуктивностью гуанилспецифической рибонуклеазы и стабильностью..

Поставленйая цель достигаетс я тем, что в качестве продуцента гуанилрибонуклеазы используют штамм AspergiFFus cfavatus F-154. Штамм

Aspergi Zus clavatus F-154 депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика под номером ЦМПМ F-154.

Штамм образует гуанилспецифическую рибонуклеазу. Культуру выращивают

на питательной среде, содержащей соевую муку, пептон, глюкозу и минеральные соли.

Штамм AspergiEFus cEavatus продуцент гуанилрибонуклеазы - получен в результате многократных моноспоровых рассевов культуры с последующим отбором вариантов с высокой продуктивностью гуанилрибонуклеазы.

В отличие от известной культуры, предлагаемый штамм продуцирует гуанилрибонуклеазу в количестве до 60 ед/мл по модифицированному методу Анфинсена и др. или 12540 ед/мл по методу фирмы Worthington и имеет высокую стабильность - сохраняет способность продуцировать гуанилрибонуклеазу при хранении не менее 15 лет без селекционной работы. Гуанилрибонуклеаза Aspergif us cfavatus эффективна в синтезе тринуклеози дифосфатов(Виоорганическая химия, |976, 2, 1111:, 1977, 3, 1475 .

Предлагаемый штамм имеет следую-, щие характеристики. .

Морфологические признаки.

Высота крнидиеносцев до I мм, толщина около 35 мкм, размер вздутий 140-190 65 мкм, размер головок 400700 мкм, боковых стеригм 7-9-2,5 мкм верхних 9-112,5 мкм, конидий 4-6 на 3,5-4 мкм.

Культуральные признаки.

Штамм растет при 24 С и рН среды

5.7- 5,9.

При выращивании на твердой среДе Чапека на третьи сутки роста колонии плоские, голубовато-зеленые, 1,9 см в диаметре с узким белым краем и крупными каплями зкссудата. К пятым суткам колония достигает 4 см в диаметре, серединка приподнимается, образуется один спороносный валик, колония становится порошистой, капли экссудата мельче. К Ю-м суткам колония 5 см в диаметре, порошистая, темно-СИЗО-голубоватая с мелкими каплями экссудата.

При выращивании на картофельноморковной среде и РСА на третьи сутки колонии голубовато-зеленые,

1.8см в диаметре с приподнятой серединой. Воздушный мицелий развит слабо, крупные капли экссуда та. На пятые сутки колонии 3 см в . диаметре, серо-голубые с приподнято серединой и двумя валиками споронос ных зон, на которых расположены капли экссудата. Край колоний паути нистый, голубовато-зеленый. Обратна сторона бесцветная., К 9 - 10-м сутк колония достигает 4,5 см в диаметре паутинистая, зеленовато-серого цвет с горками спор по зональному валику На картофельно-глюкозовой среде РДА на третьи сутки колония 2,5 см в диаметре, голубовато-зеленая, компактная с широким белым краем, приподнятой серединой. Большие капл экссудата. К пятым суткам диаметр колонии 4,5 см, цвет.серо-голубой, имеется спороносная середина и два спороносных валика. Край колонии паутинистый, белый. Экссудата нет. Обратная сторона желтоватая. К9-19-м суткам диаметр колонии 5 см, колония резко зональная порошистая, голубовато-серая. Обратная сторона желтоватая. Мелкие kaпли экссудата. На солодовой среде на третьи сутки роста диаметр колонии 1,2 см цвет голубовато-зеленый, середина приподнята. Скудный воздушный мицелий. Имеется экссудат. На пяты сутки роста диаметр 4 см, колония прижатая, паутинистая с одним спороносным валиком серо-голубого цвета. Край колонии паутинистый, серо-зеленый. Редкие капли экссудат Обратная сторона бесцветная. К 9-10-м суткам роста диаметр колонии достигает 6 см, колония пор шистая, голубовато-серая, в центре резко зональная с валиком спор. Капли экссудата, При глубинном выращивании на среде, содержащей,%: глюкоза 5,0; пептона 1,0; 7Н20 0,5; CaCCj-ZH O 0,01; KNO 0, 24 i 1°С мицелий представляет собой бледно-зеленовато-желтую равномерну грибницу, состоящую из длинных развет вленных гиф, постепенно переходящих из одной фазы развития в другую. Физиологические признаки. Хорошо усваивает сахарозу, глюко зу, хуже маннозу, фруктозу, маннит, глицерин. Пептонизирует молоко. Разжижает желатину. Гидролизует крахмал. Обра зует внеклеточную гуанил-специфичную РНКазу, гомологичную РНКазе . Т AspergiPPus orysae при выращивании в колбе при 24+1с. Наибольшая активность гуанилрибонуклеазы в культуральной жидкости имеет место у 3- и 5- суточных культур. Максимальная активность .внутриклеточного фермента наблюдается у 3- суточных культур. Суммарная активность культуральной жидкости в 3-10 раз превьш)ает суммарную активность мицелия. При действии культуральной жидкости на рибонуклеиновую кислоту в качестве продуктов гидролиза обнаружены и идентифицированы адениловая, гуаниловая, уридиновая и цитидиновая кислоты. Приготовление питательных сред. Картофельно-морковная среда, г/л: картофель 20,0; морковь 40,0; агар +2,0. Картофельно-глюкозная среда, г/л: картофель 200,0; глюкоза 20,0; агар 2,0. Солодовая среда, г/л: солодовый экстракт 20,0; агар 2,0. Пример 1. Культуру AspergiРPUS cfawatus F-154, хранящуюся на скошенном агаре на среде Чапека с сахарозой, выращивают на среде, содержащей , г/л; соевая мука 0,5; глюкоза 5,0; пептон 1,0; 0,05; CaCfj безв. 0,01; КШ 0,2 рН до стерилизации 6,2 - 6,3), в течение суток при 24+lc в колбах емкостью 750 мл с объемом указанной среды 100 мл на качалке при 180200 об/мин. Посевной материал в количестве 10% добавляют в среду вьппе указанного состава и культивируют при тех же условиях ь течение 3 сут. Активность гаунилрибонуклеазы Определяют при рН 7,8 с использованием в качестве субстрата -дрожжевой РНК-11а(НПО Биохимреактив)и выражают в спектрофотометрических единицах(Ел,д)в пересчете на 1 мл исследуемой жидкости(Безбородова С.И. и др. Микробиология, 1968, 37, 1, 10). Активность гуанилрибонуклеазы 48,0 ед/мл(9338 ед/мл по методу фирмы Worthington). Приме р 2. Подготоику посевного материала проводят так, как описано в примере 1. Полученную культуру в количестве 10% используют для засена ферментатора - инокулятора емкость ферментатора 30 л, объем среды 20 л).

Выращивание инокулюма проводят при , при перемешивании 300 об/мин и аэрации 0,6 объема воздуха на I объем среды щ минуту на среде указанной в примере 1. Через: сутки выросвшй инокулк в количестве iO% от объема среды передают в: ферментатор емкостью 100 л, содержа; щий 70 л указанной среда. Культ{{ри руют 72 ч при , перемешивании 300 об/мин. К 72 ч ферментации активность культуральной жидкости составляет по гуанилрибонуклёг зе 60,0 ед/мл,(12540 ед/мл по методу фйрьш Worthington) . Затем культураль-. ную жидкость обрабатывают известными

приемами с последующим вьщелением гуанилспёцйфической рибонуклеазы (Везбородова С.И. и др., Биохимия, 1969, 34, 6, И ).

Испытания штамма Aspergiffus ctawatus F-tS4 в ферментаторах НШ Биохимреактив г. Олайне показали его высокую продуктивность по гуанилспецифической рибонуклеазе: к 72 ч культивирования штамм продуцирует гуанилрибонуклеазу с активностью 40 - 60 ед/мл по модифициро ванному методу Анфинсена и др.(83бЬ 12540 ед/мл по методу фирмы Worthlngtoii ; весьма высокую стабильность штамм хранился на скошенном агаре без снижения активности 15 лет).

Штамм плесневого гриба. Аврегgi ttuB сtavatus F-154(Коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов института ВНИИГенетика, коллекционный номер ЩЯШ Г-154)-продуцент гуанилрибонуклеазы.