Изобретение относится к ветеринарной микологии, в частности к получению штамма Тrichophyton mеntagrophytes, используемого для контроля иммуногенной активности вакцин против трихофитии животных.
Известен штамм Тriсhophyton mentagrophytes N 251, используемый для контроля иммуногенной активности вакцины против трихофитии животных.
Недостатками данного штамма являются снижение его вирулентных свойств ввиду его расщепления с преобладанием слабовирулентных вариантов в популяции, а также изменчивость его характеристик по культуральным свойствам, спорообразованию, что приводит к необъективной оценке иммуногенных свойств вакцины против трихофитии животных.
Целью изобретения является получение эталонного штамма Тriсhophyton mentagrophytes, обладающего обильным конидиобразованием, однородностью состава популяции, высокими стабильными вирулентными свойствами, обеспечивающими контроль иммуногенной активности вакцин против трихофитии животных.
Штамм гриба Тriсhophyton mentagrophytes получен из эпизоотического, выделенного от больной трихофитией морской свинки, методом повышения конидиобразования, путем ступенчатого отбора колоний, стабильных по культурально-морфологическим признакам.
Штамм гриба Тrichophyton mentagrophytes депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер 18.
Штамм гриба Тrichophyton mentagrophytes N 18 характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки.
Мицелий не окрашен, ровный, ветвистый, септированный, терминальные гифы образуют полуспирали или спирали (до 5 завитков), диаметр мицелия до 3,0 мкм. Макроконидии многочисленные овальные или удлиненные, 1,5-5,0 мкм. Макроконидии единичные с количеством перегородок до 7, чаще 2-4, размером 10-30 × 3-8 мкм. Хламидоспоры, как правило, отсутствуют. Артроспоры возникают на отдельных участках мицелия, немногочисленны.
Культуральные свойства.
На сусло-агаре растет в виде плоских кремовых, порошистых колоний, растущий край ровный или паутинистый, реверс коричнево-красный, по периферии с желтоватым оттенком. Диаметр колоний 80-90 мм (25 день роста).
На агаре Сабуро растет в виде плоских кремового цвета, сильно порошистых, астероидной формы колоний с небольшим по центру пуговчатым возвышением, отдельные сегменты субстратного мицелия фиолетовые, реверс в центре кремовый с желтоватым оттенком, сегменты фиолетовые. Диаметр 70 мм.
На агаре Геннеберга растет в виде плоских кремово-желтого цвета пушисто-порошистых колоний, растущий край паутинистый, реверс по центру фиолетово-красный, по периферии желтый, диаметр 90 мм.
На агаре Геннеберга с БВК растет в виде плоских пушистых белого или белого с кремовым оттенком цвета колоний с пуговчатым возвышением по центру, растущий край ровный, реверс не просматривается, диаметр 70 мм.
На агаре Аппеля и Волленвебера растет в виде плоских пушистых колоний кремового цвета с пуговчатым возвышением по центру, растущий край паутинистый, реверс в центре темно-желтый, по периферии кремово-желтый, диаметр 90 мм.
На агаре Григораки растет в виде темно-кремового цвета сильно складчатых бархатистых, порошистых колоний, край ровный, реверс не просматривается (темно-коричневый), диаметр 90 мм.
На картофельно-глицериновом агаре растет в виде белого цвета плоских в центре, слабоскладчатых колоний, воздушный мицелий развит неравномерно (секторами), растущий край неровный, по периферии кольцо менее развитого воздушного мицелия, реверс желтый, диаметр 68 мм.
На агаре Плаута растет в виде плоских кремового цвета порошистых колоний, растущий край паутинистый, реверс не окрашен, иногда с фиолетовым оттенком, диаметр 70 мм.
На агаре Чапека растет в виде паутинистых колоний, мицелий с основном субстратный, в центре фиолетовый пигмент, диаметр 70 мм.
Спорообразование. Уровень спорогенеза штамма 18 на сусло-агаре от 20,8 до 90,8 млн/см3.
Вирулентные свойства.
При аппликации гомогенизированной культуры штамма Тr. mentagrophytes N 18 вместе со средой выращивания (сусло-агар) на скарифицированный и депиллированный участок кожи (3 x 3 см) в пояснично-крестцовой области у кроликов и морских свинок вызывает типичную клинику трихофитии. Заражающая доза для морских свинок и кроликов 0,25-0,50 млн/см3 микроконидий. На месте аппликации культуры (5-8 день) отмечается резко выраженная экссудативно-воспалительная реакция, поверхность кожи эрозируется с наслоением на ней корок толщиной более 0,5 см. Самовыздоровление кроликов в течение 28-50 дней.
Протеолитическая активность.
Штамм Тr. mentagrophytes N 18 активно образует комплекс экзопротеаз при выращивании в течение 30-45 дней на жидкой среде Сабуро или на среде Чапека с человеческими волосами.
П р и м е р 1. Культуру штамма Тr. mentagrophytes N 18 выращивают в сусло-агаре в пробирках при 26 ± 1оС в течение 14-20 дней. В пробирки с выросшей культурой заливают 5 см3 стерильной дистиллированной воды и с помощью микрологического крючка готовят суспензию спор. Отбирают пипеткой 1 см3 полученной суспензии, которую последовательно разводят до необходимой концентрации микроконидий, устанавливаемой путем подсчета с помощью камеры Горяева.
Проводят испытание на кроликах 5 заражающих доз культуры выращенного штамма Тr. mentagrophytes N 18, содержащих 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625; 0,0312 млн/см3 микроконидий.
Кроликов заражают накожным методом в пояснично-крестцовую область.
Оценку вирулентности проводят по длительности инкубационного периода, характеру и тяжести инфекционного процесса, характеру поражения кожи и волос (микрокартина), длительности переболевания животных.
Интенсивность проявления клиники заболевания оценивают в баллах: 5 баллов - резко выраженная экссудативно-воспалительная реакция, формирование корок толщиной 0,5 см, образование эрозий; 4 балла - воспалительно-инфильтративная реакция выражена слабее, толщина корок 0,3-0,5 см; 3 балла - реакция экссудативно-воспалительная умеренная, кожа сильно гиперемирована с утолщением. Корка толщиной 0,3 см, эрозии не образуются; 2 балла - гиперемия и отечность кожи выражены слабо, отмечается обильное шелушение на местах втирания культуры, корочки толщиной до 0,3 см.
Результаты заражения представлены в табл. 1.
Из табл. 1 видно, что штамм Тrichophyton mentagrophytes N 18 обнаруживает соответствие тяжести клинических признаков трихофитии в зависимости от заражающей дозы и может служить для контроля иммуногенности вакцин против трихофитии животных.
П р и м е р 2. Изучают изменчивость состава популяции культуры штамма Тr. mentagrophytes N 18 и штамма Тr. mentagrophytes N 251 (контрольный). Суспензии выращенных культур засевают на поверхность сусло-агара в чашках Петри и после инкубирования в термостате подсчитывают общее количество выросших колоний и определяют процентное соотношение в популяции колоний, различающихся по форме, морфологии и пигментации.
Результаты представлены в табл. 2.
Из табл. 2 следует, что культура гриба Тr. mentagrophytes N 18 по сравнению с культурой гриба Тr. mentagrophytes N 251 обладает достаточно гомогенным составом популяции гриба, которая сохраняется на высоком уровне до 12 пассажа.
П р и м е р 3. Изучают вирулентность выращенных культур штаммов грибов Тr. mentagrophytes N 18 и N 251 на 12 кроликах массой 2,5-3,0 кг. Оценку вирулентности проводят по исходной популяции в целом. Для этого выращенные культуры грибов после смыва разводят физиологическим раствором, подсчитывают концентрацию микроконидий с помощью камеры Горяева. Суспензию разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации 0,0625-1,000 млн/см3 и добавляют сусло-агар в равном объеме. Суспензию каждого штамма втирают в предварительно выстриженный и скарифицированный участок кожи в пояснично-крестцовой области. Испытывают 5 заражающих доз, содержащих соответственно 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 и 0,0312 млн микроконидий. За развитием инфекции и процессом самоизлечения у животных наблюдают до полного выздоровления.
При определении вирулентности культур учитывают: сроки самовыздоровления животных; характер поражения грибом кожи (макроскопически) и волос (микроскопически). Данные представлены в табл. 3.
Из табл. 3 следует, что культура гриба штамма Тr. mentagrophytes N 18 является более вирулентной для кроликов, чем культура штамма N 251. Трихофитоз у кроликов, вызванный культурой штамма гриба N 18, протекает в среднем на 10 дней дольше и в более сильной степени проявления заболевания, причем на 35 день наблюдения у контрольных животных уже отмечают отсутствие поражений кожи и волос, выделяемости гриба из исследуемого субстрата.
П р и м е р 4. Определяют эффективность культур штаммов Тr. mentagrophytes N 251 и N 18 для контроля иммуногенной активности вакцины "Ментавак". Для этого вакциной "Ментавак" иммунизируют 9 кроликов внутримышечно, двукратно с интервалом 9 дней в дозе 1 см3 на инъекцию. 6 контрольных кроликов не иммунизируют. На 42-й день после второй иммунизации 5 вакцинированных кроликов и 3 контрольных заражают накожно в пояснично-крестцовую область культурой штамма Тr. mentagrophytes N 251, а 4 других вакцинированных и 3 контрольных - культурой штамма Тr. mentagrophytes N 18.
На 32-е сутки после экспериментального заражения проводят клинический осмотр кроликов и оценку эффективности контрольных штаммов. Установлено: из числа вакцинированных и зараженных культурой штамма Тr. mentagrophytes N 251 все 5 кроликов оказались клинически здоровыми, а из 4 вакцинированных и зараженных культурой штамма Тr. mentagrophytes N 18 у двух на месте заражения имелись типичные трихофитийные поражения в виде толстых корочек с сильной гиперемией кожи, а у двух остальных гиперемия кожи была более слабой, корочки отсутствовали, но отмечалось шелушение, чешуйки обильные в виде перхоти. В группе контрольных животных, зараженных культурой штамма N 251, только у одного кролика наблюдали сильную гиперемию и наличие трихофитийных корок на месте заражения. У второго кролика поражения характеризовались обильным шелушением и слабой очаговой гиперемией. Третий кролик был клинически здоров. Все кролики (контроль), зараженные культурой штамма N 18, оказались больными и имели типичные для трихофитии поражения кожи: отечность, гиперемия, сформированные толстые корочки до 0,5 см.
Таким образом, использование культуры штамма Тr. mentagrophytes N 18 при оценке иммуногенной активности испытуемой вакцины дает более стабильные и достоверные результаты.
П р и м е р 5. Иммунизируют 10 голов телят 3-4-месячного возраста ассоциированной вакциной "Вермет" внутримышечно, двукратно, с интервалом 10 дней, в дозе 2 см3. Через 2 месяца после иммунизации этих телят, а также не иммунизированных (5 голов) телят того же возраста заражают вирулентной культурой штамма Тr. mentagrophytes N 18 в области средней трети шеи с левой стороны в количестве 2-4 млн микроконидий на очаг заражения. Результаты экспериментального заражения учитывают через 25 дней. Установлено: все 10 иммунизированных телят были клинически здоровыми, а у телят контрольной группы на месте экспериментального заражения были обнаружены плотные, сероватого цвета шелушащиеся трихофитные очаги.
Использование культуры штамма гриба Тr. mentagrophytes N 18 в биологической промышленности для контроля иммуногенной активности вакцин против трихофитии животных позволит с большей достоверностью судить о качестве изготовляемых биопрепаратов.
Использование: биотехнология, к штамму гриба Trichophyton mentagrophutes, контроль иммуногенной активности вакцин против трихофитии животных. Сущность изобретения: получен новый штамм Trichophyton mentagrophytes N 18, обладающий обильным конидиобразованием, однородностью состава популяции, стабильными вирулентными свойствами, обеспечивающий эффективный контроль иммуногенных свойств биопрепаратов против трихофитии животных. Предлагаемый штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ ветеринарных препаратов под N 18. При оценке иммуногенных свойств контрольный штамм N 18 от аналогичных отличается более стабильными и достоверными результатами. 3 табл.
Штамм гриба Trichophyton mentagrophytes ВГНКИ N 18-ДЕП, используемый для контроля иммуногенной активности вакцин против трихофитии животных.
