Способ определения госсипола в биологических материалах Советский патент 1984 года по МПК G01N31/08 

1П Изобретение относится к.способам определения госсипола ( 252-ди-1 ,,6,7 -тpиoкcи-5 изoпpoпил 8-aльдeгидoнaфтил) в семенах хлопка5 его жмыхах шротах, а также, комбикормах и тканях животных для контроля за его содержанием при производстве кормов и при диагностике токсикозов. Известен способ определения госсипола в хлопковых семенах, н шротах5 включающий экстракцию свободного госсипола диэтиловым эфироМ; кондектрациго экстракта,, реакцию госси.пола с ан -шином и пиридином к посладующее определение его количества весовым методом Связанный госсипол определяют после экстракции свободного в той же пробе путем гидролиза в присутствии анилина и последующего взвешивания госсипола 1 Известен таюке способ определения госсипола в органах и тканях животных р включающий извлечение свободног госсипола органическими растворителя ми j реакцию с анилино : после последе вательной обработки экстракта раство рителями и последующее определение госсипола по цветной реакции. Определение связанного госсипола проводя путем гидролиза его в присутртвии аниЛина после извлечения свободного .госсипола в той же навеске и поеле . дующей экстракции связанного госсипо ла гексаном 2J, Однако известные способы определе ,ния госсипола недостаточно чувстви тельны. Цель изобретения - повышение чувс вительности способа определения госсипола, Поставленная цель достигается тем что согласно способу определения гос сипола в биологических материалах, включающему экстракцию свободного госсипола из ангшизируемой пробЫ; от деление твердой фазы, гидролиз ее в присутствии анилина для выделения связанного госсипола, последующую очистку экстракта и гидролизата по еледонательной обработкой растворите лями и идентификахдаю госсипола в полученных фракциях экстракта и гидролизата по цветной реакции с хлорным железом, перед идентификацией госсипола полученные фракции подвергают дополнительной очистке путем хромате графирования . в тонком слое силикагеля. 2 . I При использовании в качестве биологических материалов хлопковых семян. жмыха, nipoTOB и комбикормов дополнит S ,п ь ную о чн с т ку X р омат о гр афи р ова ни ем . фракций5 полученных из экстракта, осутцествляют в присутствии смеси растворителей5 содержащей уксусную кислоту,, толуол и гексан в соотношении 10+1:8±1;St. При использовании в качестве биологических материалов тканей ;кивотнь;х дополнительную очистку хроматографированием фракций, полученных КЗ экстрактов, осуществляют в две стадниг причем первую стадию проводят в присутствии смеси растворителей, содержащей петролейный эфир, толуол5 ацетон и хлоро юрм в соотношении lOt : 2±1 ; 4+1 : 4±1 , а вторую - в присутствии смеси растворителей содержащей уксусную кислоту 5 толуол и гексан в соотношении 10±1;8+1:8±1, Дополнительную очистку хроматографированием фракций; полученных, из ri-щролизатаэ осуществляют в присутствии смеси растворителей; содержащей петролейный эфир и ацетон в соотношении , П р и м е р 1S Определение госсипола в хлопковых семенах шротах, жмьке и комбикормах. А„ Массу исследуемого образца измельчают на мельнице до порошкообразного состояния, тщательно перемешивают и отбирают среднюю пробу cei-шн, шрота, жмыка 2-3 г, комбикормов 5 г. Образцы помещают в колбу объемом 250 RHj, добавляют 50 мл смеси ацетона и во,цы (7;3; и 5-6 стеклянньгх бусинок. После 30 мин перемешивания экстракт проф|-5льтровывают через бумажный фильтр S колбу три раза прО1 Ывают той же смесьюt Фильтрат и смывы помещают в делительную воронку, внослт туда 10 i-ш .петролейного эфира и тщательно переметинвают,, После разделения слоев нижний5 содержащий госсипол, спивают в другую делительную BOpoHKj, а верхний слой эфира отбрасывают. Обработку петролейный э.фиром повторяютs после чего к воронку вносят 100 мл дистил.лированяой воды и . концентрированной соляной кислоты перемеигнвают и проводят обработку экстракта хлороформом. Хлороформ добавляЕот порциями 5-6 раз по 5 мл. Объединенные зслороформ15ые экстракты обьед -1нягот и выпаривают /досуха в токе воздуха. Сухие остатки из проб семян, и шротов растворяют в 10 мл, а из пробы комбикорма в 2 мл ацетона. Полученные фракции экстракта наносят на пластину Силуфол И О- . 20 sкл экстракта из образцов семян, жмыха и шротов и 50 мкл экстракта и образцов комбикорма). Хроматографирование проводят в присутствии хром тографической смеси: ледяная уксусная кислота - толуол - гексан в соотношении 11:9:9 или 9:7:7. После того, как фронт растворителей прохо дит 10 см. пластику вынимают из камеры, просушиваюти опрыскивают 5%-ным раствором хлорного железа в 50%-ном этаноле. Rf госсипола сост вил в первом случае 0,8, во втором 0,85; пятна округлые, оливко-серого цвета на желтом фоне, Б. Для освобождения связанного госсипола в колбы с остатками материала после извлечения свободного го сипола (твердая фаза )добавляют 10 м ацетона в пробы семян, жмыха и шрото или 10 нл 72%-ного этилового спирта в пробы комбикорма и 1 мл свежеперегнанного анилина. Колбы закрывают и помещают на 30 мин в водяную баню (температура 60-70°С ), после чего охлаждают, К полученным гидролизатам добавляют 50 мл гексана, выдерживают при встряхивании 30 мин, а затем гек сановые фракции гидролизатов в делительных воронках 5-6 раз по 5 мл промывают 0,2н, раствором соляной кислоты. После разделения слоев гексановые фракции гидролизатов высушивают досуха в токе воздуха. Сухой остаток растворяют в 10 мл (пробы из семян, жмыха и шротов ) или в 2 мл ад тона ( пробы из комбикормов ) и нанося на пластины Силуфол по 20 или 50 мк соответственно, параллельно наносят стандартный раствор дианилингоссипол Хроматографирование проводили в при сутствии смеси растворителей: петролейньм эфир - ацетон в соотношении 14:9 или 16:11, .

После того, как фронт растворителей проходит 10 см, -пластины подсушивают и проявляют 5%-ным раствором хлорного железа в 50%-ном этаноле. Пятна округлые, коричневого цвета, Rf в первом случае 0,6, во втором 0,55.,

П р и м е р 2, Определение госси-1 пола в образцах мьшщ, почек, печени.

Чувствительность предложенного способа определения госсипола для определения свободного госсипола в кормах составляет 0,15 мг/кг, в тканях животных 0,02-0,05 мг/кг, связанног-о во всех субстратах 0,05 мг/кг. Абсолютная чувствительность обнару:Жения стандартного вещества в тонком 1слое силикагеля составляет: свобод724А, К 5 г тщательно измельченных кусочков тканей, помещенных в колбы объемом .250 мл, добавляют 50 мл ацетона. После 30-минутного встряхивания пробы профильтровывают в делительные воронки, к фильтратам добавляют примерно равный объем петролейного эфира и 10 мл 1%-ного раствора буры. После повторной обработки слоя эфира 10 мл раствора буры его отбрасывают, в делительную воронку вносят 100 мл дистиллированной воды и 1 мл концентрированной соляной кислоты, а затем проводят обработку экстракта ХЛОРОФОРМОМ, ХЛОРОФОРМ добавляют порциями три раза по 5 мл при интенсивном встряхивании. Хлороформные фракции госсипола объединяют и выпаривают в токе воздуха. Полученные сухие остатки растворяют в . мл ацетона. По 100 мкл ацетоновых фракций госсипола наносят на пластины Силуфол. Хроматографиров.ание фракций экстракта проводят в присутствии системы растворителей: петролейньш эфир - толуол - ацетон хлороформ в соотношении 9:1:3:3 или 10:2:4:4 или 11:3:5:5, причем, когда фронт растворителей доходит до противоположного края пластины, ее вынимают, подсушивают и помещают в камеру с хроматографической смесью, состоящей из ледяной уксусной кислоты толуола - гексана в соотношении 10:8:8. Когда фронт растворителей проходит 10 см, пластину вынимают, подсушивают и опрыскивают хлорным железом, Rf 0,8-0,85, пятна узкие, оливко-серого цвета на желтом фоне, Б, Гидролиз Остатков образцов тканей (твердая фаза) для определения связанного госсипола проводят также, как в примере 1, После нанесения ацетонового раствора фракций гидролизата на пластину ее помещают в камеру с хроматографической смесью: петролейный эфир - ацетон в соотношении 15:10. Rf 0,6-0,55, пятна узкие, коричневого цвета на желтом фоне. S1 кый госсипол 0,03-0,01 мкг, связанный 0,1 мкг. Степень определения св бодного госсипола составляет 70-80% связанного 100%. Более высокая чувствительность предложенного способа определения госсипола в хлопковых шрртад по . сравнению с известгым способом (гост 13979.11-69) пбказана в табл. (определение госсипола в хлопковых шротах J, . В таблв 2 представлены результат определения госсипола в тканях жи вотных согласно предложенному способу, Таким образом, предложенный способ определения госсипола обладает высокой чувствительностью, что позволяет обнаруживать его в любых субстратах и в самых небольших количествах, а это, в свою, очередь, позволяет гарантировать профилактику токсикозов, вызванных госсиполом. Кроме того, предложенный способ определения госсипола прост в исполнении, для проведения анализа не требуется сложное оборудование, а время проведения анализа по сравнениюс известным способом значительно сокращается. Таблица 1

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОССИПОЛА В БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛАХ, включающий экстракцию свободного гсссипола из анализируемой пробы, отделение твердой фазы, гидролиз ее в присутствии анилина для выделения связанного госсипола, последующую очистку экстракта и гидролизата последовательной обработкой растворителя и идентификацию госсипола в полученных фракциях экстракта и гидролизата по цветной реакции с хлорным железом, отличающийся тем, что, с целью повьшения чувствительности способа, перед идентификацией госсипола полученные фракции подвергают дополнительной очистке хроматографи- рованием в тонком слое силикагеля. 2.Способ по п.1, отличающий с я тем, что при использовании в качестве биологических материалов хлопковых семян, жмыха, шротов и комбикормов дополнительную очистку хроматографированием фракций, полученных из экстракта, осуществляют в присутствии смеси растворителей, содержащей уксусную кислоту, толуол и гексан в соотношении lOtl:8+1:8±. 3.Способ по п.1, отличающий с я тем, что при использовании в качестве биологических материалов тканей животных дополнительную очистку хроматографированием фракций, по3 лученных из экстрактов, осуществляют в две стадии, причем первую стадию проводят.в присутствии смеси растворителей, содержащей петролейный эфир, толуол, ацетон и хлороформ в соотношении lOi :2±1:4±1;4±1, а вторую - в присутствии смеси растворителей, содержащей уксусную кислоту, толуол и гексан в соотношении 10+1:8+1 8tl. 4.Способ по п.1, отличаюю щий с я тем, что дополнительную Од очистку хроматографированием фракций, 00 1C полученных из гидролизата, осуществляют в присутствии смеси растворителей, содержащей петролейный эфир и ацетон в соотношении 15±1:10+1.

5 5

10 30

Мышцы

Мыпаш

Т-а блица 2

70

7,0

80 24,0

При данных количествах свободный госсипол не определяли, а исследовали его, как связанный госсипол.

Продолжение табл,2