Способ получения инсулина Советский патент 1984 года по МПК A61K38/28 A61K35/14 

00 СП

о

Изобретение относится к биологии и меицине, и может быть использовано в пракических целях для разработки способа промышленного получения наиболее эффективого для медицинских целей лечебного препарата инсулина человека; в научных целях дя изучения . механизмов интернализации, епонирования и транспорта инсулина эритроцитами; для диагностического выявления резервов гормона в , форменных элементах крови лиц, подозреваемых в возможном развитии диабета и других эндокринных расстройств; для изготовления человеческого стандарт-инсулина и стандартных инсулинов различных животных.

Известен способ получения как гормона инсулина, так и медицинского препарата из поджелудочной железы путем экстракции его подключенным 70° спиртом с последующей многоэтапной очисткой экстракта от примесей белков и липидов .

Однако известный способ не пригоден для получения инсулина человека.

.Известен также способ получения инсулина из крови или компонентов крови теплокровных животных, при этом кровь или форменные элементы предварительно разбавляют 0,5-0,4 объемами гидрофильного разбавителя, доводят рН полученного раствора от 2-4 до 8-10 и инкубируют обработанную таким образом кровь при 15- 40°С по крайней мере несколько часов. Далее кровь охлаждают до 10°С, диализуют после нейтрализации через мембрану, проницаемую для молекул с мол. мае. 6000 и из диализата выделяют органические пептидсодержащие вещества, имеющие мол. мае 350-6000 и инсулиноподобную активность 14-40 мкед/мг твердого вещества.

Практическое применение способа позволило получить в среднем из 100 л крови животных до 320 г целевого продукта, активность которого равна 14-40 мкед/мг при определении ее по биологическому действию на выделенных адипоцитах 2.

Таким образом, техника извлечения по этому способу инсулина дает малый выход, сложна, трудоемка и продолжительна, требует при операциях изменения рН и температуры. После инкубации из смеси извлекается далеко не весь гармон, а только тысячная его часть. Форменные элементы и плазма крови после получения инсулина не могут быть использованы в гематологии и для научных целей.

Цель изобретения - повышение активности и выхода инсулина.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения инсулина, включающему в себя инкубацию компонентов крови и последующее выделение целевого продукта, инкубации подвергают отмытые эритроциты кров.и человека, которые выдерживают в течение 90-120 мин в растворе, содержащем физиологический раствор и этанол при соотнощении эритроциты-физиологический раствор и этанол 1:1:0,007- 0,014, затем эритроциты отделяют от супернатанта и выделение инсулина проводят путем гель-фильтрации супернатанта на сефадексе или осаждением с последующей кристаллизацией.

Способ осуществляют следующим образом.

Отделяют эритроциты от плазмы крови путем отстоя или центрифугирования. К эритроцитарной массе добавляют изотонический раствор хлористого натрия (9 г. на литр) в соотнощении 1:10. Смесь перемещивают и центрифугируют при 2000 об в минуту .(g 800) в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают. Эритроцитарную массу промывают, таким образом, три раза.

После отмывания к эритроцитам добавляют изотонический раствор NaCl, содержащий этанол так, чтобы соотношение объемов эритроциты, физиологический раствор, этанол, составляло 1:1:0,007-0,014. Инкубацию

полученной смеси проводят при 20°С и полиэтиленовой емкости. Время инкубации 90- 120 мин. Затем путем центрифугирования (g 800; 10 мин) отделяют супернатант. Эритроциты и отделенная вначале процесса плазма крови годны для дальнейщего использования в гематологии. Полученный супернатант подвергают биохимическому фракционированию для выделения инсулина. Инсулин получают путем гель-фильтрации на колонке с сефадексом Г-5.л высотой 80 см и диаметром 1,5 см. В качестве элюирующего раствора применяют дистиллированную воду. Скорость элюции для препаративных целей 0,3 мл/мин, для аналитических - 0,06 мл/мин. Собирают фракции 2,37-2.75 Ve/Vo. Собранные фракции при необходимости дополнительно обессаливают на сефадексе Г-10.

Полученный раствор инсулина можно подвергнуть дальнейшей очистке и получить кристаллический порошок, с этой целью осаждают аморфный цинкинсулин с добавлением 10% CHjCOO/2 Zn, доводя рН до 6,0 и осаждая гормон при 4°С в течение 24 ч. Осадок отделяют и растворяют в 0,1 н лимонной кислоте, добавляют 5% Zn Clj и ацетон, поддерживая рН 6,0. Процесс

кристаллизации продолжают при 4°С в течение 46 ч, после чего отделяют выпавшие кристаллы гормона. Кроме того, оказалось возможным, применяя указанную .методику, осадить инсулин и без предварительного отделения балластных белков на колонке,

хотя в этом -случае степень очистки гормона ниже и не образовывались кристаллы инсулина, выпавший .осадок содержит ИНСУЛИН.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА, включающий в себя инкубацию компонентов крови и последующее выделение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и активности инсулина, инкубации подвергают отмытые эритроциты крови человека, которые выдерживают в течение 90-120 мин в растворе, содержащем физиологический раствор и этанол при соотношении эритроциты-физиологический раствор и этанол 1:1:0,007- 0,014, затем эритроциты отделяют от супернатанта и выделение инсулина проводят путем гель-фильтрации ,супернатанта на сефадексе или осаждением с последующей кристаллизацией.