СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНСУЛИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к разделу экспериментальной и клинической иммунологии и биохимии и может быть использовано в НИИ и в отделениях больниц при обследовании больных с повышенным уровнем сахара в крови.

Наиболее близким способом того же назначения к заявленному способу является способ определения инсулиназной активности эритроцитов, включающий инкубацию исследуемого гемолизата эритроцитов с меченым [¹²⁵J]-иисулином, растворение фрагментов разрушенного [¹²⁵J]-инсулина трихлоруксусной кислотой и отделение центрифугированием от оставшегося цельного инсулина, выпадающего в осадок. По радиоактивности последнего, подсчитанной при помощи гамма-счетчика, определяется инсулиназная активность исследуемой крови (см. Йонушас Б.С. Инсулиназная активность крови у здоровых лиц и больных сахарным диабетом //Автореф. дисс...канд. мед. наук, М., 1989. - с.9). Аналогов нет.

К причинам, препятствующим достижению указанного результата при использовании известного способа, принятого за прототип, относят то, что в известном способе в инкубации гемолизата используется радиоактивный инсулин, являющийся нестабильным соединением с периодом полураспада 3-8 мин (Duckworth W.C. Insulin degradation: mechanisms, products and significance), при этом сам способ требует специальной радиоиммунологической лаборатории с определенной степенью защиты лаборатории.

Инсулиндеградирующие ферменты инсулиназы обнаружены во многих органах и тканях [1, 2], в том числе и в эритроцитах человека [3, 4]. Из-за сложности биохимических методов определения инсулиназ определение их как с научно-исследовательской целью, так и в клинической практике ограничено. Технический результат - повышение доступности и надежности метода.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Инкубацию гемолизата эритроцитов производили с раствором немеченого инсулина, взятых в соотношении 4:1 соответственно (5 мл гемолизата:1,25 мл раствора инсулина) в течение 1,5 часов при температуре 37°С в термостате. Расчет инсулиназной активности проводили, определяя исходный уровень инсулина в гемолизате и уровень гормона после икубации с раствором инсулина при длине волны 540 нм.

Проведенный заявителем поиск по патентным источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил аналогов, характеризующихся признаками, тождественными всем существующим признакам заявленного изобретения. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию “новизна”.

Предлагаемый способ определения инсулиназной активности эритроцитов может быть реализован следующим образом (на примере).

Пример. Из вены пациента отбирают 3 мл крови в гепаринизированные пробирки, добавляют 6 мл физиологического раствора и, после трехкратного центрифугирования при 3000 g в течение 5 мин и температуре -4°С, плазму и верхний слой кровяных телец отделяют. Затем эритроцитарную массу дважды промывают 0,9%-ным раствором и для ее гемолиза добавляют холодную дистиллированную воду в соотношении 1:10 соответственно, после чего центрифугируют 30 мин при 15000 g и температуре -4°С для отделения мембран эритроцитов. Надосадочную жидкость хранят при -20°С до момента исследования. Для определения инсулиназной активности эритроцитов используют ИФА-набор для определения инсулина 449-1600 (INSULIN - DSL-10-1600). Разморозив надосадочную жидкость, ее центрифугируют при 3000 g в течение 5 мин и температуре -4°С и разливают равным количеством в пробирки на определение уровня эндогенного инсулина и на инкубацию с экзогенным инсулином для определения инсулиназной активности. Изначально определяется уровень эндогенного инсулина. Для этого выбирают необходимое для анализа количество ячеек планшета, в каждую из которых добавляют по 25 мкл стандартов инсулина А-Е, 25 мкл контролей 1 и 2 и по 25 мкл исследуемых образцов. Пипеткой вносят 100 мкл раствора ферментного конъюгата в каждую ячейку и инкубируют их на орбитальном шейкере при 500-700 об/мин в течение 1 часа при комнатной температуре (≈25°С). Затем промывают планшет, удаляют содержимое всех ячеек и промывают промывочным буфером пять раз. Резко стряхивают планшет над фильтровальной бумагой и промокают остатки влаги. Добавляют 100 мкл хромогенного раствора ТМБ в каждую ячейку и вновь инкубируют планшет на орбитальном шейкере ори 500-700 об/мин в течение 10 мин при ≈25°С. Добавляют 100 мкл стоп-реагента в каждую ячейку и в течение 30 мин измеряют оптическую плотность каждой ячейки при 450 нм. Определяют исходные концентрации инсулина в контролях и образцах, после чего определяют вышеописанным способом уровень инсулина в образцах гемолизата, предварительно инкубированного с раствором немеченого инсулина (0,05 мл на пробу гемолизата эритроцитов - 0,2 мл) в термостате в течении 1,5 часов при температуре 37°С с экзогенным гормоном с соотношении 4:1 соответственно.

Предлагаемым способом была определена инсулиназная активность эритроцитов 9 здоровых детей (7-14 лет) и 26 детей (7-14 лет) с гипергликемией. Кроме того, активность фермента оценивалась в эритроцитах белых беспородных крыс весом 100-150 г со стрептозотоциновым диабетом (уровень глюкозы в сыворотке крови не менее 13,5 ммоль/л) - 20 здоровых животных и 38 - с экспериментальным СЗТЦ диабетом. В таблице приведены результаты исследования.

Таким образом, вышеизложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании заявляемого следующей совокупностью условий:

- способ определения инсулиназной активности эритроцитов, воплощающий заявляемое изобретение при его осуществлении, предназначен для использования в экспериментальной и клинической иммунологии при диагностике сахарного диабета и определения уровня инсулина эритроцитов;

- для способа определения инсулиназной активности эритроцитов в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- способ определения инсулиназной активности эритроцитов, воплощающий заявляемое изобретение при его осуществлении, способен обеспечить достижение усматриваемого заявителем практического результата.

Список литературы

1. Сологуб Л.И., Пашковская И.С., Сухорская И.Е. Расщепление инсулина ферментами клеток животных и человека // Пробл. эндокр., 1990, №2, с.90-93.

2. Матулявичюс В.А., Варейкис Э.Й., Лашас Л.В., Панков Ю.А. Инсулиндеградирующий комплекс гемолизата эритроцитов человека // Докл. АН СССР. - 1984. - Т.279.-№1. - С.237-240.

3. Duckworth W.C., Hamel F.G., Bennett R., Ryan M.P., Roth R.A. Human red blood cell insulin-degrading enzyme and rat skeletal muscle insulin protease share antigenic sites and generate identical products from insulin //J. Biol. Chem. 1990 Feb. 15. - Vоl. 265. - №5. - Р.2984-2987.

4. Duckworth W.C. Insulin degradation: mechanisms, products, and significance //Endocr. Rev.- 1988 Aug. - Vol. 9. - №3. - P.319-345.

Изобретение относится к области медицины, в частности к экспериментальной и клинической иммунологии. Способ обеспечивает повышение доступности и надежности определения инсулиназной активности эритроцитов млекопитающих. Гемолизат предварительно инкубируют с немеченым инсулином в соотношении 4:1, уровень инсулина до и после инкубации определяют по изменению оптической плотности раствора при длине волны 540 нм. 1 табл.

Способ определения инсулиназной активности эритроцитов млекопитающих, отличающийся тем, что гемолизат предварительно инкубируют с немеченным инсулином в соотношении 4:1, уровень инсулина до и после инкубации определяют по изменению оптической плотности раствора при длине волны 540 нм.