Способ определения Т @ - лимфоцитов человека Советский патент 1990 года по МПК G01N33/53 

1

(21)4420931/28-14

(22)04.05.83

(46) 30,04.90. Бюл. Р 16

(71)Научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней и Алма-Атинский государственный институт усовершенствования врачей

(72)И.Г.Цой, Р.С.Идрисова, б.И.Кри- фукс и М.П.Суслова

(53) 615.375 (088.8) (56) Moretta Т,., Ferrarini М. , Cooper M.D. - Characterization of hunan T-cell subpopulations as defined by specific receptors for immu- noglobulinas. In.: Contemporary To- picsin Immunology, 1978, v 8, p.19-45.

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Т«-ЛИМФОЦИТОВ

ЧЕЛОВЕКА

(57) Изобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии. Цель изобретения - повышение чувствительности способа и его упрощение за счет исключения этапа выделения Т-лимфоцитов. У обследуемых людей берут кровь, выделяют лимфоциты и смешивают с эритроцитарным диаг- ностикумом, приготовленным путем сенсибилизации эритроцитов кур с иммуноглобулином человека. Предварительно диагностикум прогревают при 45 С в течение 1 ч после чего лимАоциты инкубируют с эритроцитами барана, Наличие в крови обследуемых Ти-лим- фоцитов определяют по числу комплексных розеткообразующих клеток. В сравнении с прототипом увеличивается чувствительность на 1,6%. Упрощение способа достигается за счет исключения этапа предварительного выделения Т- лимфоцитов.

о

&

(Л

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии. Цель изобретения - повышение чувствительности способа и его упрощение за счет исключения этапа выделения Т-лимфоцитов. У обследуемых людей берут кровь, выделяют лимфоциты и смешивают с эритроцитарным диагностикумом, приготовленным путем сенсибилизации эритроцитов кур с иммуноглобулином человека. Предварительно диагностикум прогревают при 45°С в течение 1 ч. После чего лимфоциты инкубируют с эритроцитами барана. Наличие в крови обследуемых Тγ - лимфоцитов определяют по числу комплексных розеткообразующих клеток. В сравнении с прототипом увеличивается чувствительность на 1,6%. Упрощение способа достигается за счет исключения этапа предварительного выделения Т-лимфоцитов.

Изобретение относится к медицине, тз частности к клинической иммунологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа и его упрощение за счет исключения этапа предварительного выделения Т-лимфо- цитов.

Способ осуществляют следующим образом.

20%-ную взвесь тщательно отмытых фосфатным буфером эритроцитов смешивают с 7,2%-ным раствором ацетальде- гида рН-7,2 в равных объемах. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 5-7 сут, после чего эритроциты трижды отмывают в фосфатном буфере и вновь доводят до 20%-ной концентрации. Затем один объем 5%-ных фиксированных эритроцитов кур смешивают с тремя объемами раствора нормального иммуноглобулина класса G(IgG) сыворотки человека в концентрации 80 мг/мл, полученного гельфильт-

рацией на сефадексе С-50, рП-6,8. Смесь встряхивают и прогревают в водяной бане при 45°С в течение 60 мин. Сенсибилизированные эритроциты трижды отмывают 0,9%-ным раствором NaCl, рН-7,2, содержащим эмбриональную сыворотку в разведении 1:300. Отмытый эритроцитарный диагностикум (RA-реагент) консервируют 0,05%-ным раствором азида натрия.

Лимфоциты, выделенные путем седиментации на одноступенчатом градиенте фйколл-верографина (плотность 1,077 г/мл), доводят до концентрации клеток в 1 мл средой № 199. 1()0 мл клеточной взвеси смешивают со 1()0 мкл 1%-ной взвеси эритроцитарного Д11агностикума. Смесь инкубируют 13 мин при 37°С с последующим добав1561041А

показали высокую чувствительность и специфичность предлагаемой тест- системы. Так, титр в РИГА с анти- IgG-сывороткой превышал разведение 1:1280, тогда как с анти-1р,М-сыворот- кой агглютинация вообще отсутствовала.

Пример 2, Специфичность реагирования предлагаемой тест-системы с FcRv лимфоцитами проверялось путем взаимного истощения общего пула лимфоцитов от FcR,, -положительных клеток. Мононуклеары инкубировали с одной тест-системой 15 мин при 37 С, центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин и вновь инкубировали 90 мин при 4°С,

10

15

25

30

лфнием 200 мкл 1%-ной взвеси натив- HI|IX эритроцитов барана. Далее смесь цфнтрифугир.уют при 1000 об/мин в те- 5 мин и помещают в холодильную камеру (4-6°С) на 90-120 мин. После

окончания инкубации полученный осадок чатом градиенте плотности фиколл- ооторожно встряхивают. Подсчет проводят в нативных препаратах под покровным стеклом в световом микроскопе (ув, 400х). За комбинированную розетку принимают лимфоциты, фиксировавшие на своей поверхности одновременно двух эритроцитов кур и барана.

Пример 1. Для проверки специфичности и точности полученных результатов по предлагаемому способу н& лимфоцитах доноров была проведена серия опытов для доказательства не- врзможности формирования спонтанных рЬзеток лимфоцитов с фиксированными а етальдегидом эритроцитами кур, не нагруженными IgG. Результаты опытов показали, что исследуемые эритроциты не формируют спонтанных розеток с мо- нрнуклеарами периферической крови человека.

Следовательно, при использовании сенсибилизированных IgG - человека эритроцитов кур розеткообразование обусловлено взаимодействием Fc-фраг- ментов иммуноглобулина класса G с соответствующими рецепторами (FcRv,)

t,О

лимфоцитов.

С целью определения специфичности и чувствительности предлагаемой т ест- -системы для идентификации FcRv лимфоцитов (сенсибилизированные IgG эритроциты кур) диагностикум был ис- Щытан в РПГА микрометодом в 96-луноч- ных планшетах типа Такачи с использованием моноспецифических антиимму- ноглобулиновых сывороток против IgM и IgG человека (производства НИИ эпидемиологии и микробиологии Им.Н.Ф.Гамалеи) . Результаты проверки

затем освобозщали от FcRv, -клеток путем их седиментации на одноступенверографина (1,077 г/см3). С моно- нуклеарами, собранными из интерфазы, ставили реакцию ЕА-розеткообразова- ния с известной тест-системой.

После истощения общего пула моно- нуклеаров от FcR« -клеток как с помощью известной, так и предлагаемой тест-систем дополнительные розетки практически не выявлялись (лимфоциты, присоединившие к своей поверхности более 3 эритроцитов, встречались в единичных случаях).

Разработанный стабилизированный ЕА-реагент выявлял большее количест- во FcRv -мононуклеаров, тогда как после взаимодействия лимфоцитов с ЕА-реагентом известного способа опре- делялось еще некоторое количество на клетках при использовании

40

45

50

55

FcRv.

разработанного ЕА-реагента (2,2Ј ±0,4%, в первой серии опытов - 0,6+ +0,2%, р/0,001),т.е. чувствительность была на 162 выше предлагаемого реагента в сравнении с известным.

Следовательно, предлагаемый ЕА-реагент обладал более высокой чувстви1- тельностью и специфичностью при идентификации FcRv на мононуклеарах периферической крови человека.

Кроме того, предлагаемый способ проще в сравнении с прототипом за счет исключения этапа предварительного выделения Т-лимфоцитов„

Формула изобретения

Способ определения Ту-лимфоцитов человека, включающий забор крови, выделение лимфоцитов, инкубацию их

затем освобозщали от FcRv, -клеток путем их седиментации на одноступен5

0

чатом градиенте плотности фиколл-

верографина (1,077 г/см3). С моно- нуклеарами, собранными из интерфазы, ставили реакцию ЕА-розеткообразова- ния с известной тест-системой.

После истощения общего пула моно- нуклеаров от FcR« -клеток как с помощью известной, так и предлагаемой тест-систем дополнительные розетки практически не выявлялись (лимфоциты, присоединившие к своей поверхности более 3 эритроцитов, встречались в единичных случаях).

Разработанный стабилизированный ЕА-реагент выявлял большее количест- во FcRv -мононуклеаров, тогда как после взаимодействия лимфоцитов с ЕА-реагентом известного способа опре- делялось еще некоторое количество на клетках при использовании

0

5

0

5

FcRv.

разработанного ЕА-реагента (2,2Ј ±0,4%, в первой серии опытов - 0,6+ +0,2%, р/0,001),т.е. чувствительность была на 162 выше предлагаемого реагента в сравнении с известным.

Следовательно, предлагаемый ЕА-реагент обладал более высокой чувстви1- тельностью и специфичностью при идентификации FcRv на мононуклеарах периферической крови человека.

Кроме того, предлагаемый способ проще в сравнении с прототипом за счет исключения этапа предварительного выделения Т-лимфоцитов„

Формула изобретения

Способ определения Ту-лимфоцитов человека, включающий забор крови, выделение лимфоцитов, инкубацию их

51561041 6

в присутствии эритроцитов баранаспособа и его упрощения за счет ис- и иммуноглобулинового эритроцитарно- ключення этапа вьщеления Т-лимфоциго диагностикума и по количеству тов, в качестве эритроцитарного диагкомбинированных розеткообразующихностикума используют эритроциты кур,

клеток определяют Ту-лимфоциты,5 сенсибилизированные иммуноглобулином

отличающий с я тем, что,человека, и добавляют его перед инкус целью повышения чувствительностибацией с эритроцитами барана.