СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ БАКТЕРИЙ Российский патент 1994 года по МПК C12N1/20 C12N9/22 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения биомассы бактерий для медицинской промышленности.

Известен способ получения биомассы с использованием в качестве стимулятора роста панкреатической ДНКазы. Для увеличения выхода биомассы на 20-40% в среду, инокулированную микробными клетками до плотности 20-50 млн/мл, добавляют панкреатическую ДНКазу.

Недостатком известного способа является дороговизна использования ДНКазы 1, которая является дефицитным медицинским препаратом, а также невысокий выход биомассы.

Описан также способ получения биомассы с использованием нуклеаз микробного происхождения. Способ заключается в том, что в питательную среду вносят инокулят в начале стационарной фазы роста до плотности 40-60 млн/мл и одновременно в качестве стимулятора роста микробную эндоДНКазу гомологичного штамма или внеклеточную нуклеазу Serratia marcescens ВКПМ-2349.

Недостатком данного способа является ограниченность использования в качестве инокулята культуры только в одной фазе роста, а также невысокий выход биомассы.

В качестве прототипа выбран способ получения биомассы дрожжей Candida tropicalis K-1 [3] , включающий использование в качестве стимулятора роста бактериальной РНКазы в низких концентрациях 0,1-0,0001 мкг белка/мл. Основным недостатком применения (прототип использовался для наращивания биомассы дрожжей), а также многостадийность процесса наращивания биомассы.

Целью изобретения является упрощение процесса, увеличение выхода биомассы, расширение области применения и использование РНКаз различных штаммов B. intermedius.

Цель достигается тем, что культуру микроорганизмов смывают с агаризованной среды, доводят до плотности 100 млн/мл и в нее вносят РНКазу Bacillus intermedius в концентрации 0,1-0,001 мкг/мл.

Предложенная совокупность признаков является новой, существенно отличается от известных и позволяет достичь положительного эффекта в виде увеличения выхода биомассы, сокращения сроков получения биомассы, уменьшения количества фермента, вследствие использования малых объемов сред при описанном способе выращивания культуры, что ведет к удешевлению процесса в целом. Использование РНКазы имеет большое практическое значение для выращивания штаммов-зубиотиков, используемых в качестве медицинских препаратов.

РНКазы Bacillus intermedius (штаммы 7Р, 1041, 3-19) выпускаются экспериментальным заводом. Удельная активность ферментов 1 млн. ед/мг белка.

О приросте биомассы судили по увеличению оптической плотности при культивировании в микробиологическом комплексе "Avantage".

Способ иллюстрируется примерами. Примеры 1-3, 7-9, 13-15, 19-21, 25-27, 31-33, 37, 38 описывают предлагаемый способ. В примерах 4-8, 10-12, 16-18, 22-24, 28-30, 34-36, 39, 40 выращивание проводилось аналогично прототипу.

П р и м е р 1. Двухсуточную культуру Lactobacillus fermentum 2953 с агаризованной среды МРС (дрожжевой экстракт - 5,0; мясная вода - 10,0; Bactopepton - 10,0; глюкоза - 20,0; аммоний лимоннокислый - 2,0; натрий уксуснокислый - 5,0; цистеин HCl - 0,4; твин-80 - 1,0; К₂НРО₄ - 2,0; MgSO₄ 7H₂O - 0,2; MnSO₄ H₂O - 0,04; сорбированная кислота - 0,4; агар-агар - 20,0; рН 6,2-6,6 (г/л) смывают жидкой средой того же состава и доводят до плотности 100 млн/мл. Полученную суспензию помещают в ячейки по 2 мл и вносят РНКазу B. intermedius 1041 до конечной концентрации 1-0,0001 мкг/мл. Для создания анаэробных условий сверху наслаивают 0,2 мл вазелинового масла. Ячейки помещают в микробиологический комплекс "Avantage". Результаты 5-часовой инкубации представлены в табл. 1.

П р и м е р 2. Двухсуточную культуру L. fermentum 1-20 смывают, суспендируют и выращивают в среде, аналогично примеру 1. Результаты 5-часовой инкубации представлены в табл. 1.

П р и м е р 3. Двухсуточную культуру L. fermentum АТСС 9338 смывают, суспендируют и выращивают аналогично примеру 1. Результаты 5-часовой инкубации представлены в табл. 1.

П р и м е р 4. Двухсуточную культуру L. fermentum 2953 смывают с поверхности агаризованной среды и суспендируют в среде МРС (пример 1). Полученную суспензию культивируют при 30^оС в стационарных условиях до середины экспоненциальной фазы роста. Затем клетки отделяют, суспендируют в свежей питательной среде (100 млн/мл) и добавляют РНКазу B. intermedius 1041 до конечной концентрации 1 - 0,0001 мкг/мл. По 2 мл суспензии помещают в ячейки и сверху наслаивают по 0,2 мл вазелинового масла. Результаты 5-часовой инкубации в микробиологическом комплексе "Avantage" представлены в табл. 1.

П р и м е р 5. Подготовка культуры, питательные среды, условия выращивания и изучение действия РНКазы штамма 1041 проводят аналогично примеру 4. Используют культуру Lactobacillus fermentum 1-20. Результаты исследований представлены в табл. 1.

П р и м е р 6. Подготовка культуры, питательные среды, условия выращивания и изучение действия РНКазы штамма 1041 проводят аналогично примеру 4. Используют культуру L. fermentum АТСС-9338. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1, добавление РНКазы штамма 1041 в момент смыва с агаризованной среды приводит к значительному увеличению выхода биомассы.

П р и м е р 7. Суточную культуру E. coli M-17 (колибактерин) с агаризованной среды Адамса (NH₄Cl - 1,0; KH₂PO₄ - 1,5; NaHPO₄ - 3,5; MgSO₄ - 0,1; г/л) смывают жидкой средой того же состава и доводят до плотности 100 млн/мл. Получают суспензию помещают в ячейки по 2 мл и вносят РНКазу штамма 1041 до конечной концентрации 1-0,0001 мкг/мл. Ячейки помещают в микробиологический комплекс "Avantage". Результаты 12-часовой инкубации представлены в табл. 2.

П р и м е р 8. Суточную культуру E. coli 083 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 7. Результаты представлены в табл. 2.

П р и м е р 9. Суточную культуру E. coli K-12 G62 смывают, суспендируют и выращивают аналогично примеру 7. Результаты инкубации представлены в табл. 2.

П р и м е р 10. Суточную культуру E. coli M-17 смывают с поверхности агаризованной среды и суспендируют в среде Адамса (пример 7). Получение суспензии, условия выращивания и изучение действия РНКазы штамма 1041 проводят аналогично примеру 4. Результаты исследований представлены в табл. 2.

П р и м е р 11. Подготовка культуры, питательные среды, условия выращивания и изучение действия РНКазы проводят аналогично примеру 10. Используют культуру E. coli 083. Результаты опытов представлены в табл. 2.

П р и м е р 12. Подготовка культуры, питательные среды, условия выращивания и изучение действия РНКазы проводят аналогично примеру 10. Используют культуру E. coli K-12 G62. Результаты опытов представлены в табл. 2.

Как видно из данных табл. 2 добавление РНКазы штамма 1041 в смыв с агаризованной среды приводит к увеличению выхода биомассы в 1,5-2,0 раза.

П р и м е р 13. Двухсуточную культуру Bifidobacterium bifidum ЛБА-3 (бифидобактерин) смывают с агаризованной среды (пептон - 10,0; мясной экстракт - 3,0; NaCl - 3,0; Na₂HPO₄ - 2,0; твин-80 - 1,0; цистеинHCl - 0,5; цистин - 0,5; азидNa - 0,1; лактоза - 15,0; MgSO₄ 7H₂O - 0,0012; MnSO₄ 2H₂O - 0,0008; агар-агар - 20,0; г/л. рН 6,8-7,0) смывают жидкой средой того же состава и доводят до плотности 100 млн/мл. Полученную суспензию помещают в ячейки по 2 мл и вносят РНКазу штамма 1041 до конечной концентрации 1-0,0001 мкг/мл. Для создания анаэробных условий наслаивают 0,2 мл вазелинового масла. Ячейки помещают в микробиологический комплекс "Avantage". Результаты 20-часовой инкубации представлены в табл. 3.

П р и м е р 14. Двухсуточную культуру B. adolescentis МС-42 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 13. Результаты 20-часовой инкубации представлены в табл. 3.

П р и м е р 15. Двухсуточную культуру B. longum 379 смывают, суспендируют и выращивают аналогично примеру 13. Результаты 20-часовой инкубации представлены в табл. 3.

П р и м е р 16. Двухсуточную культуру B. bifidum ЛБА-3 смывают с поверхности агаризованной среды и суспендируют в жидкой среде (пример 13). Получение суспензии, условия выращивания и изучение действия РНКазы штамма 1041 проводят аналогично примеру 4. Результаты исследований представлены в табл. 3.

П р и м е р 17. Подготовка культуры, питательные среды, условия выращивания и изучение действия РНКазы проводят аналогично примеру 16. Используют культуру B. adolescentis МС-42. Результаты исследований представлены в табл. 3.

П р и м е р 18. Подготовка культуры, питательные среды, условия выращивания и изучение действия РНКазы проводят аналогично примеру 16. Используют культуру B. longum 379. Результаты исследований представлены в табл. 3.

Как видно из данных табл. 3 добавление РНКазы штаммы 1041 в смыв с агаризованной среды ведет к увеличению выхода биомассы на 10-30% в сравнении с прототипом.

П р и м е р 19. Двухсуточную культуру L. fermentum 2953 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 1. В качестве стимулятора роста используют РНКазу B. intermedius 7P. Результаты 5-часовой инкубации представлены в табл. 4.

П р и м е р 20. Двухсуточную культуру L. fermentum 1-20 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 19. Результаты 5-часовой инкубации представлены в табл. 4.

П р и м е р 21. Двухсуточную культуру L. fermentum АТСС 9338 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 19. Результаты 5-часовой инкубации представлены в табл. 4.

П р и м е р 22. Двухсуточную культуру L. fermentum 2953 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 4. В качестве стимулятора роста используют РНКазу B. intermedius 7P. Результаты 5-часовой инкубации представлены в табл. 4.

П р и м е р 23. Подготовка культуры, питательные среды, условия выращивания и изучение действия РНКазы проводят аналогично примеру 22. Используют культуру L. fermentum 1-20. Результаты исследований представлены в табл. 4.

П р и м е р 24. Подготовка культуры, питательные среды, условия выращивания и изучение действия РНКазы проводят аналогично примеру 22. Используют культуру L. fermentum АТСС 9338. Результаты исследований представлены в табл. 4.

Как видно из табл. 4 добавление РНКазы штамма 7Р в момент смыва со среды способствует более высокому выходу биомассы.

П р и м е р 25. Двухсуточную культуру Bifidobacterium bifidum ЛВА-3 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 13. В качестве стимулятора роста используют РНКазу B. intermedius 7P. Результаты 20-часовой инкубации представлены в табл. 5.

П р и м е р 26. Двухсуточную культуру B. adolescentis МС-42 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 25. Результаты 20-часовой инкубации представлены в табл. 5.

П р и м е р 27. Двухсуточную культуру B. longum 379 смывают, суспендируют и выращивают аналогично примеру 25. Результаты 20-часовой инкубации представлены в табл. 5.

П р и м е р 28. Двухсуточную культуру B. bifidum ЛВА-3 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 16. В качестве стимулятора роста используют РНКазу штамма 7Р. Результаты исследований представлены в табл. 5.

П р и м е р 29. Двухсуточную культуру B. adolescentis МС-42 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 28. Результаты 20-часовой инкубации представлены в табл. 5.

П р и м е р 30. Двухсуточную культуру B. longum 379 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 28. Результаты 20-часовой инкубации представлены в табл. 5.

Как видно из табл. 5 использование РНКазы штамма 7Р на стадии смыва с агаризованной среды приводит к увеличению выхода биомассы.

П р и м е р 31. Суточную культуру E. coli 083 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 7. В качестве стимулятора роста используют РНКазу B. intermedius 3-19. Результаты 12-часовой инкубации представлены в табл. 6.

П р и м е р 32. Суточную культуру E. coli М-17 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 31. Результаты 12-часовой инкубации представлены в табл. 6.

П р и м е р 33. Суточную культуру E. coli K-12 G62 смывают, суспендируют и выращивают в среде аналогично примеру 31. Результаты 12-часовой инкубации представлены в табл. 6.

П р и м е р 34. Подготовка культуры, питательные среды, условия выращивания проводят аналогично примеру 10. В качестве стимулятора роста используют РНКазу B. intermedius 3-19. Результаты опытов представлены в табл. 6.

П р и м е р 35. Подготовка культуры, питательные среды, условия выращивания и изучение действия РНКазы штамма 3-19 проводят аналогично примеру 34. Используют культуру E. coli 083. Результаты опытов представлены в табл. 6.

П р и м е р 36. Подготовка культуры, питательные среды, условия выращивания и изучение действия РНКазы штамма 3-19 проводят аналогично примеру 34. Используют культуру E. coli K-12 G62. Результаты опытов представлены в табл. 6.

Как видно из таблицы использование предлагаемого способа внесения фермента приводит к увеличению выхода биомассы по сравнению с прототипом.

П р и м е р 37. Подготовка культуры, питательные среды и условия выращивания аналогично примеру 13. В качестве стимулятора роста используют РНКазу B. intermedius 3-19. Результаты 20-часовой инкубации представлены в табл. 7.

П р и м е р 38. Двухсуточную культуру B. longum 379 смывают, суспендируют и выращивают аналогично примеру 37. Результаты 20-часовой инкубации представлены в табл. 7.

П р и м е р 39. Культура микроорганизмов, получение суспензии, условия выращивания аналогичные примеру 16. В качестве стимулятора роста используют РНКазу штамма 3-19. Результаты 20-часовой инкубации представлены в табл. 7.

П р и м е р 40. Подготовка культуры, питательные среды, условия выращивания и изучение действия РНКазы 3-19 проводят аналогично примеру 39. Используют культуру B. longum 379. Результаты 20-часовой инкубации представлены в табл. 7.

Данные таблицы свидетельствуют о большей эффективности использования предлагаемого способа внесения фермента по сравнению с прототипом.

Предложенный способ имеет следующие преимущества перед прототипом:
1. Позволяет увеличить выход биомассы в 1,5-2,0 раза при использовании тех же концентраций РНКазы.

2. Предложенный способ существенно упрощает использование РНКазы в качестве стимулятора роста для получения биомассы, поскольку добавление фермента осуществляется на самом первом этапе культивирования, а именно в момент смыва с агаризованной среды.

3. Предложенный способ сокращает процесс получения биомассы.

4. Использование предложенного способа удешевляет процесс наращивания биомассы как в следствие добавления малых количеств РНКазы на этапе подготовки инокулята, так и за счет сокращения периода получения самого инокулята.

5. Позволяет использовать РНКазы от различных штаммов B. intermedius.

6. Является широко доступным не только в лабораторных, но и в производственных условиях. (56) Авторское свидетельство СССР N 1507788, кл. С 12 N 1/16, 1988.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: культуру микроорганизмов смывают с агаризованной среды, доводят до плотности 100 млн/мл и в нее вносят бактериальную РНКазу в концентрации 0,1 - 0,001 мкг/мл. Предложенный способ позволяет увеличить выход биомассы в 1,5 - 2,0 раза при использовании тех же концентраций РНКазы. 1 з. п. ф-лы, 7 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ БАКТЕРИЙ, предусматривающий культивирование их на питательной среде с добавлением в качестве стимулятора роста РНКазы Bacillus intermedius, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода биомассы, упрощения, удешевления процесса и расширения области применения, РНКазу bacillus intermedius в концентрации 0,1 - 0,001 мкг/мл добавляют на стадии смыва с агаризованной среды. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют РНКазу bacillus intermedius штаммов 7Р или 1041, или 3 - 19.