Штамм перевиваемых клеток МСВ,используемый для культивирования риккетсий и вирусов Советский патент 1985 года по МПК C12N5/00 

60 CD СП 1 Изобретение относится к экспериментальной биологии и может быть использовано для генетических исследований. Известна перевиваемая линия клеток L, полученная из эмбрионов мышей 1 . Однако она контаминирована микоплазмами, вирусами и клетками других линий. Известен также штамм перевиваемых клеток мышей М-22 с высокой интенси ностью размножения С23. Этот штамм получен путем трансформации эмбриональных фибробластов С57В L вирусом SV-40, однако он не способен пролиферировать при супраопт 1мал;1ной температуре. Целью изобретения является получение нового штамма перевиваемых клеток, обладающего высокой интенси ностью размножения, формирующего стабильный Пласт фибропластоподобных клеток, чувствительного к возбу дителям риккетсиозных инфекций и вирусам, не контаминированного ми- коплазмами и вирусными агентами и способного пролиферировать при супр оптимальных температурах. Поставленная цель достигается с помощью штамма перевиваемых клеток МСВ. Штамм хранится в коллекции переви ваемых клеток позвоночных Института вирусологии им. Д.И. Ивановского под номером 44/6/, Для получения штамма МСВ перевиваемых клеток используют эмбрионы, стерильно извлеченные из матки мышей С57В /6/в последние дни беременности. Тела эмбрионов измельчают и подвергают трипсиниза1 1и при 37°С в О,25%-ном растворе трипсина. Суспензию клеток в концентрации 1-10 клеток в 1 мл среды 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота в объ ме 250 МП вносят в матрацы. В первый месяц культивирования П) оизведены два пересева в отношен и 1:2. После второго пересева раз множение клеток практически прекращается. В матрацах образуется рыхла сеть, состоящая из крупных, полимор ных клеток с длинными отросткаьт. Жизнеспособность этих клеток поддер живают, периодически сменяя питател ную среду. Через 3 мес после первич ного высева эмбриональных клеток в 512 одном из шести матрацев обнаруживают колонию мелких, округлых плотно прилегающих друг к другу клеток. Размеры колонии постепенно увеличиваются за счет митотического датения клеток. Колонию снимают с поверхности стекла матраца и переносят в пробирку с 1 мл питательной среды. Клетки этой колонии являются началом перевиваемой линии клеток МСВ. Линия клеток МСВ поддерживается в лаборатории риккетсиозов ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи в течение 6 лет, проведено CBbmie 350 пассажей с высоким индекСом пролифера и - 6. Штамм перевиваемых клеток МСВ Имеет следующие морфологические, физиологические и кариологические характеристики. Культура МСВ состоит из фибробластоподобных клеток веретеновидной и полигональной формы с четкими границами. Ядро круглое или овальное, четко контурировано, содержит 2-3 небольших ядрышка, кариоплазма заполнена мелкозернистым хроматином. Цитоплазма клеток мелкозернистая, как правило, не вакуолизирована, без В1шючений. Рост клеток однослойный. При фиксации препаратов жидкостью Буэна или смесью по Шабадашу окраска их гематоксилином и зозином несколько слабее, чем, например, перевиваемых мышинных клеток L. При высеве единичные клетки в процессе размножения образуют островки полигональной формы, которые по мере роста сливаются, формируя сплошной пласт клеток. При высеве 10 клеток в 1 мл сплошной пласт в пробирке или флаконе (матраце) образуется на 4-5-е сутки. Клетки легко отделяются от стекла 0,02%-ным раствором версена, 0,25%-ным раствором трипсина или механическим путем. Адгезивная активность клеток Хорошая. Пересев клеток МСВ производят после образования сплошного пласта.При пересеве механическим путем из сосуда удаляют старую питательную среду и добавляют 1-10 мл (в зависимости от емкости сосуда для культивироваНИЯ-) свежей среды, в которую очищают шпаделем клетки со стекла. Взвесь клеток доводят свежей питательной средой до требуемой концентрации и высевают в новые сосуды. Пересевы с помощью версена или трипсина произ водят по известной методике. ,Культура клеток МСВ адаптирована питательной среде следующего состава: среда 199 отечественного производства с 10% (нативной) сыворотки крупного рогатого скота без антибиотиков. Добавление антибиотиков пенициллина и стрептомицина (100 ед/мл) - не влияет на морфологию и пролиферативную активность клеток МСВ. Хранение клеток МСВ. Для поддержания жизнеспособности клеток МСВ их пересевают 1 раз в 4-7 дней при разведегии клеточной суспензии 1:5-1:8. В условиях термостата при пласт клеток сохраняется в течение 10 сут без смены пита тельной среды. При комнатной темпера туре 18-21°С клетки сохраняются в те чение двух недель. Изучаемая культура является гетеро плоидной с широкими колебаниями числа хромосом (20-100). При этом 9% клеток содержит более 100 хромосом. Метафазные пластинки со свойственным для клеток мыши числовым набором хромосом (40) составляют 3% всей клеточной популяции. Модальный класс равен 82-84. Модальный класс составляет около трети всей клеточной попу ляции. При исследований 10 метафазных пластинок, входящих в модальный класс, видно, что большую часть хромосомного набора составляют акроцент рические хромосомы (74-80). Кроме того, присутствуют метацентрические и субметацентрические хромосомы; в 8 из изученных клеток были обнаружены микрохромосомы. Тесты на о.нкогенность отрицательны. Подкожное введение клеток линии МСВ гомологичным (мыши линии С57В L/6)-и гетерологичным (беспородные белые мыши) мьш1ам в дозе 3-10 клеток не вызывало образование опухолей в период двухмесячного наблнадения. Чувствительность к микроорганиз мам. Перевиваемая линия клеток МСВ чувствительна к. риккетсиям возбудителя эпидемического сыпного тифа (Rickettsia prowazeka) и риккетсиозной оспы (R. akari) и к вирусам VSV и ЕМС. 51Л Уровень накопления риккетсий определяют на пятые сутки после заражения клеток перевиваемой линии МСВ путём титрования на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) 6 7-дневного возраста. Риккетсий Пррвачека поддерживаются с сохранением инфекционносТи в течение многих пассажей на клетках перевиваемой линии МСВ со средним уровнем накопления 5,5 1 . Размножение риккетсий Провачека в клетках перевиваемой линии МСВ сопровождается развитием цитопатических изменений. Культивирование риккетсий и вирусов с использованием штамма перевиваемых клеток МСВ. Пример 1. Способ культивирования риккетсий Провачека, штамм Brein 1. В матрацную колбу с клетками линии МСВ на уровне 150-го пассажа вводят 0,02%-ньй раствор версена, подогретый до 35°С. Через 1 мин версен удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при 35°С на 5 мин. Отслоившиеся клетки ресуспендируют в среде роста: среда 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота и разливают на 4 матрацные колбы.Эти культуры 151-го пассажа инкубируют при 37°С в течение 2 .сут до момента формирования сплошного слоя. При заражении риккетсиями среду из культуральных сосудов сливают, клетки трижды пpo ЛIвaют раствором Хэнкса и вводят суспензию риккетсий, полученную из желточного мешка РКЭ и разведенную 1:500. Контакт осуществляют в течение 2 ч при 35 С. Затем инокулюм удаляют, культуру трижды отмывают раствором Хенкса от неадсорбировавшихся риккетсий и добавляют среду -роста и инкубируют при 35С. Сбор риккетсий производят через 4 для после заражения и определяют титр их накопления на 6 - 7 -дневных РКЭ. Титр равен 5,3 log I Д /мл. Часть матрацных колб с риккетсиями, В1 тращенными на клетках перевиваемой линии МСВ, заморажива1рт и хранят в минусовом холодильнике. Храп .гше риккитсий в течение двух ет (время набл1Ьдения) не приводит к снижению титра ин(1)екционностк. Риккетсии Провачека прошли более 20 пассажей на культурах клеток МСВ с сохранением титра 5,5 log I Д/мл. Пример 2. Способ культивирования Rickettsia akari, штамм МК. Клетки перевиваемой линии МСВ на уровне 180-го пассажа получают и зар жают риккетсиями по способу, описан{номув примере 1 . Титр риккетсий равен .Л,5 logl fljjj/Mn. Пример 3. Способ культивиро вания вируса VSV. Кпетки линии МСВ на уровне 232-го пассажа получают по способу, описанному в примере 1. При заражении вирусом среду из культуральных .сосудов сливают, клетки трижды промывают раствором Хенкса и вводят 1 МП среды, содержащий 100 доз вируса, выдерживают 1 ч при , затем трижды промывают раствором Хенкса для удаления неадсорбировавшегося вируса и заливают поддержи вающей средой - среда 199 с 2% сыворотки крупного рогатого скота и инкубируют при 37°С. Сбор вируса производят через 24 ч после заражения (полная дегенерация клеточного пласта) и определяют титр вируса по раз,-ВИТИЮ цитопатического эффекта. Титр равен 10 . При культивировании вируса на перевиваемой линии клеток его титр равен . Пример 4. Способ культивирования вируса ЕМС. Клетки линии МСВ на уровне 235-го пассажа получают по способу, описанному в примере 1, а заражение вирусом и инкубирование производят по способу, описанному в примере 3. Сбор вируса производят через 48 ч после заражения (полная дегенерация клеточного пласта). Титр равен .to ТЦЦ50/М При культивировании вируса ЕМС на перевиваемой линии клеток его титр равен 10 . Пример 5. Клетки линии МСВ высевают в матрацы со средой 199 и 10% сыворотки в дозе Ю в 1 мп и через 3-5 сут культивирования их снимают Со стекла трипсином, версеном или механическим путем и полученную, суспензию подсчитывают в камере Горяева или Фукса - Розенталя. Кпетки, выращенные на разных сериях среды 199 отечественного производства дают накопление от 5-10 до 10 клеток в 1 мл, т.е. увеличение исходного количества происходит в 5-10 раз. Перевиваемая линия клеток МСВ в отличие от аналога и прототипа обладает способностью интенсивной пролиферации при культивировании при супраоптимальной температуре 40 С с сохранением вьсокого накопления клеток, сравнимого с накоплением при оптимальных температурах 35 . Способность перевиваемой линии клеток МСВ при 40С позволяет применять ее в генетических исследованиях, в частности для вьщеления и изучения температурочувствительных (ts) мутантов риккетсий и вирусов. Кроме того, перевиваемая линия клеток МСВ отличается .высокой пролифе:ративной активностью, легкостью субкультивирования, не требует особых видов питательных сред и дефицитной эмбриональной сыворотки телят, возможностью культивирования как в присутствии антибиотиков, так и без них обладает устойчивыми морфологическими, -биологическими и уникальными от других перевиваемых линий мьшей генетическими особенностями.

Штамм перевиваемых клеток МСВ № 44/6/ (коллекция перевиваемых клеток позвоночных Института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР), используемый для культивирования риккетсий и вирусов. (П с: