Способ выделения компонентов из пыльцы покрытосеменных растений Советский патент 1985 года по МПК A01G7/00 A01H1/04 

4 СП

со ел

4

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в исследованиях по получению в селекционных целях гаплоидных растений в культуре изолированных генеративных клеток in vitro, дЛя получения из этих клеток протопластов, а также для улучшения мужского гаметофита растений.

Цель изобретения - повышение процента и ускорения процесса выделения живых неповрежденных генеративных клеток.

Пример. Проводят выделение генеративных клеток из пыльцы растений люцерны изменчивой сорта Зайкевича. Зрелую пыльцу помещают в растворы углевода с различным осмотическим давлением, устанавливают изотонический для нее, в котором не г;роисхо;1.ит ее изливание и не отмечается плазмолиз у пыльцевых зерен. Затем готовят раствор углврда (например, D-сорбита) с величиной осмотического давления по данному способу (например, 10%-ный раствор с осмотическим давлением 14,7% от изотонического). В чашки Петри диаметром 6 см наливают по 2 мл 10%-ного раствора D-сорбита. Шпателем собирают пыльцу с цветков растений и стряхивают в чашки Петри. Перемец1иванием раствора достигают равномерного распределения пыльцевых зерен- в его объеме. Чашки оставляют на 2-ч при комнатной температуре. В течение этого времени в них происходит изливание пыльцы и выделение генератив. ных клеток. Через 2 ч выделившиеся генеративные клетки отделяют с помощью центрифугирования от других продуктов выделения - оболочек и веществ цитоплазмы вегетативных клеток излившихся пыльцевых зерен, а также от неизлившейся пыльцы. После этого генеративные клетки используют по назначению. Для определения живых выделенных генеративных клеток применяют витальный краситель-синька Эванса в 0,5%-ном растворе. /у1ертвые клетки этим красителем окрашиваются в синий цвет, а живые не окрашиваются. Процент поврежденных генеративных клеток определяется подсчетом под микроскопом генеративных клеток с поврежденной оболочкой.

С использованием этого способа достигнуто массовое выделение живых неповрежденных генеративных клеток у некоторых видов растений.

В таблице представлены результаты выделения генеративных клеток из растений.

В результате изучения выделения генеративных клеток у данных видов растений установлено, что максимальное количество живых неповрежденных клеток выделяется в гипотоническом растворе углевода, с ос.мотическим давлением в интервале 10-50% осмотичности раствора изотонического для их пыльцы. Установлено, что 95% от общего количества пыльцы, изливающейся в гипотоническом растворе за время инкубации в нем, приходятся на первые 2-3 ч. Определено, что при плотности пыльцы свыше 200 тыс. на 1 мл гипотонического раствора существенно уменьшается количество излившейся пыльцы. Поэтому, если за счет неравномерного распределения пыльцевых зерен в объеме гипотонического раствора резко увеличится плотность в отдельных его частях, вследствие этого произойдет уменьшение процента излившейся пыльцы и, соответственно процента выделения генеративных клеток. Установлено, что температура гипотонического раствора 20-30°С наиболее оптимальна для выделения генеративных клеток из пыльцы.

.

10-15

Д-сорбит

Д-сорбит

Д-глюкоза Сахароза

50-60

150

35-45

150

3-12 3 --... Вика посевная Д-сорбит4-9(Vicia sativaL) Сахароза Дурман безвредныйД-сорбит6-10 (Datura, innoxia Mill) ,„.- ,,. Yi ::r::i::r:r:i. 1145954 4 Продолжение таблицы 10030-40 15030-40