Способ индикации нитевидного вируса пчел Советский патент 1984 года по МПК C12N7/00 

O5

00

4;

СЛ

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в .частности к разработке спосо-ба индикации нитевидного вируса пчел (НВП).

НВП вызывает заболевание медоносных пчел, сопровождающееся потерей способности к полету, паргшичом конечностей, наличием гемолимфы молочно-белого цвета, разрушением клеток гемолимфы в пчелиной семье наблюдают постоянную небольшую гибель пчел, либо семья погибает. В соременных условиях развития крупных пчеловодческих и матковыводных совхозов НВП может нанести большой экономический утцерб народному хозяйству.

Морфологические признаки. Частицы НВП эллипсоидной формы, размером 400-100 нм или 450-150 нм, состоят из нуклеокапсида, размером 3000-60 или 3000-40 нм, заключенного в оболочку.

Физико-химические свойства. Нуклеокапсид содержит двухнитевую ДНК с молекулярным весом приблизительно 12-10 Дальтонов, плавучие плотности в хлористом цезии целой частицы, нуклеокапсида и ДНК - равн соответственно 1,28; 1,36 и 1,71 r/ Частица НВП содержит примерно 12 белков с молекулярными весами от 13 до 70 кД, которые приблизительнс равномерно распределены между обо-, лочкой и нуклеокапсидом.

Биологические свойства. НВП. поражает только медоносных пчел, рабочих особей и маток. Он обнаружен в следующих органах пораженных особей: мозге, вентральном нервном тяже, глоточных, верхнечелюстных и восковых железах, жировом теле, большой ядовитой железе и резервуаре этой железы,средней кишке, яичн ках и гемолимфе. Репродукция вируса отмечена лишь в жировом теле и яичниках. В инфицированных, клетках жирового тела и яичниках отмечено разрушение ядерных оболочек. Экспериментальная инфекция была вызвана .у йзрослых рабочих пчел при скармливани,и или иньекции выруссодержащих препаратов. Не удалось заражение пчелиных личинок 1-го возраста, мышат-сосунов, 21-дневных мьвиёй, тараканов и. личинок большой восковой моли. НВП широко распространен в США, Англии, обнаружен в Японии, Новой Зеландии и Италии.

НВП был обнаружен с помощью электронно-ми-кроскопического исследования экстрактов из мертвых пчел или гемо 1имфы из живых пчел 1

Недостатком известного способа индикации является то, что электронный микроскоп является уникальной дорогостоящей аппаратурой и не доступен практическим лабораториям.

Цель изобретения - повышение эффективности способа индикации нитевидного вируса пчел.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу индикации нитевидного вируса пчел, включающему постановку реакции двойной иммунодиффузии в агаре испытуемого антигена с иммунной сывороткой, в качестве иммунной сыворотки используют кроличью гипериммунную сыворотку, полученную с помощью штамма Apis fiPamentous Virus № 31.

Для получения кроличьей гипериммунной сыворотки в качестве антигена испол.ьзуют вирионы НВП ш.та1«ма № 31. Пчеп в количестве 100-150 шту зараженных данным штаммом и погибших от НВП, механически гомогенизируют общепринятым методом с добавлением 0,01-0,03 М фосфатного буфера рН 7,0-7,2 (1 мл на пчелу). Гомогёнат осветляют при 1800-2000 g 8-10 мин, супернатант центрифугируют при 8000-10000 g 20-25 мин. Осадок суспендируют в 2-3 мл 0,010,03 М фосфатного буфера рН 7,0-7,2 и концентрированную вируссодержйщую суспензию центрифугируют в градиенте плотности сахарозы от 20 до 60% в течение 3-3,5 ч при 3000032000 д. Собирают фракцию, содержащую вирус, при -помощи подходящего шприца с иглой, доводят ее до объема 3-4,5 мл физиологическим раствором, делят на три .равные части, разливают во флаконы и замораживают.

Гипериммунизац 1я кроликов. Перед первой инъекцией одНу часть- полученного антигена размораживают, смешивают с полным адъювантом Фрейнда соотношении 1:1 и вводят кролику в подушечки задних лапок по 0,20,3 МП, в бедренные мьшцы по 0,50,75 мл и внутрикожно в три точки спины по 0,2-0,3 мл. Вторую инъекцию делают через 21 день, при зтом одну часть антигена размораживают, доводят физиологическим раствором до объема 2-3 мл и вводят кролику внутривенно. Третью инъекцию делаю внутривенно аналогичным образом череэ 7 дней после второй. Обескровливание кроликов проводят на 7-10 день после третьей инъекции, кровь собирают в стерильную колбу, вБщерживают при З7с до образовани сгустка, отделяют от стенок стерилной стеклянной пгшочкой и оставляют при на ночь. На следующий день сыворотку отсасывают, консервируют мертиолятом в соотношении 1:5000-1:10000 и запаивают в ампулы

Исследуемых пчел в количестве 8-12 штук гомогенизируют механически с добавлением 8-12 мл дистиллированной воды. Гомогёнат оставляют

при 1000г2000 g в течение 8-10 мин супернатант центрифугируют при 8000-10000 g в течение 20-25 мин. Образовавшийся осадок суспендируют в 0,1-0,2 мл дистиллированной воды и используют в качестве с.нтигена. Одновременно аналогичным образом готовя контрольный положительный антиген из пчел, погибших от НВП штамма 31. Используют агар Дифко. В качестве растворителя для приготовления 0,9-1%-ного раствора геля применяют 0,1-0,2 М боратный буфер (рН 8,4-8,5) с добавлением 5-8 г хлористого натрия на 1л раствора. Реакцию ставят в чашках Петри или на предметном стекле. Учет реакции проводят по формированию полос преципитации.

Данный способ может быть представлен в двух вариантах: макрометодом по Ouchterfoni (1948) и микрметодом по Mansi (1958).

.Макрометод. В чашке Петри или н предметном стекле получают слой агарового геля толщиной 1,5-2 мм, вырезают лунки диаметром 5-7 мм (расстояние между лунками 3-6 мм). Лунки заполняют антисывороткой и антигенами до краев/ инкубируют во влажной камере при комнатной температуре. Учет реакции проводят через 24-36 ч по формированию поло преципитации.

Микромет.од. В чгияке Петри или на предметном стекле получают слой агарового геля толщиной 0,8-1,5 WM (расстояние между лунками 1,41,6 мм). Лунки заполняют антисывороткой и антигенами до краев, инкубируют во влажной камере при 3537 С. Учет реакции проводят через 3-6 ч по формированию полос преципитации .. Использование микрометояа реакции двойной иммуиодиффузии снижает расход реагентов, сокращает время получения результатов реакции.

Приготовление антигена для реакций. Восемь исследуемых пчел гомогенизируют механически с добавлением 8 мл дистиллированной воды. Гомогенат осветляют при 1000 g в течение 8 мин, супернатант центрифугируют при 8000 g 20 мин. Образовавшийся осадок суспендируют

B 0,1 мл дистиллированной воды и используют в качестве антигена. В макро- или микрометоде реакции двойной иммунодиффузии с гомологичной ,антисывороткой полученный

o антиген образует 1-2 полосы преципитации.

10 исследуемых пчел томог&нкзируют механически с добавлением 10 мл дистиллированной воды. Гомое генат осветляют при 1500 g в течение 9 мин, супернатант центрифугир5тот при 9000 g в течение 22,5 мин. Образовавшийся осадок суспендируют в 0,15 мл дистиллированной воды и используют в качест0ве антигена. В макро- или микрометоде реакции двойной иммунодиффузии с гомологичной антисывороткой полученный антиген образует 1-2 полосы преципитации.

5

12 исследуемых пчел гомогенизируют механически с добавлением 12 мл дистиллированной воды. Гомогенат осветляют при 2000 g в течение 10 .мин, супернатант центри0 фугируют при 10000 g в течение 25 мин. Образовавшийся осадок суспендируют в О,2 мл дистиллированной воды и используют в качестве антигена. В макро- или мнкро5 методе реакции двойной иммунодиффузии с гомологичной антисывороткой полученный антиген образует 1-2 полосы преципитации.

Предложенный способ апробирован

Q нами с положительньм результатом в лабораторных условиях.

Предложенный способ является простым, доступньвл и достоверным. Применение его в ветеринарной практике позволит своевременно выяв5лять данный вирус. Способ найдет применение в научно-исследовательских институтах, областях и районных ветбаклабораториях.

СПОСОБ ИНДИКАЦИИ НИТЕВИЦНО-ГО ВИРУСА ПЧЕЛ, включёиоадий постановку реакции двойной иммунодиффузйи в агаре испытуемого антигена с иммунной сывороткой, о-т л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью повышения эффективности способа, в качестве иммунной сыворотки исполь:зуют кроличью гипериммунную сыво,ротку, полученную с помощью штамма Apis filamentous virus 31.