Полипептид,обладающий способностью уменьшать содержание кальция в сыворотке Советский патент 1983 года по МПК C07K14/585 A61K38/23 

о

ND

ЭО

3D 55

ND Изобретение относится к син.тезу нового соединения - полипептида, обладающего способностью уменьшать содержание кальция в сыворотке, ко торый может найти применение в био гии и медицине.. Известен человеческий кальцитонин, обладающий способностью умень maiV содержание кальция в сыворотке tl. Человеческий кальцитонин характеризуется нашичием дисульфидной связи, которая крайне нестабильна и легко разлагается или полимеризу ется, кроме того, его стабильность как фармацевтического соединения мала. Цель изобретения - расширение а сенала средств воздействия на живо организм. Поставленная цель достигается предлагаемым полипептидом формулы . (CHOs1 -Co-6iy-A$rv-Leu-Ser-Trp-KNCHCO-Wel-Leu-Giy-Trp-Tyr-Trp-em-Agp-Phe-ASt - L|j$-ptTt-Ry$-rrp-Phe-Pro-Clu-Trp-Ai -3ie-&iy-v-Qi- .-vtQ-Mj - ацетат обладающим способность, снижать содержание кальция в сыворотке. В предлагаемом полипептиде L-Cys в 1-м и 7-м положениях заменен с(-пробковой кислотой: .НООС(СН2)5-CH-IIH.2 I . ,СООН карбоксильная группа в LU -положении связана с глицином с образованием циклической структуры. Предлагаемый полипептид обладает высокой химической стабильностью и в 10 раз превосходит по биологической активности человеческий каль цитонин. Поскольку предлагаемый кальцитонин имеет ту же последовательность аминокислот,.что и челове ческий с 11-го по 32-й фрагмент}, то он является иммунологически иден тичным, с природным человеческим кальцнтонином и, следовательно, фар мацевтически безопасным и не имеет перекрестной иммунности со свИным или лососевым кальцитонином 2 }. Синтез предлагаемого соединения может быть Осуществлен с помощью обычного метода синтеза пептидов СЗ, т.е; аминокислоту и/или пептид состоящий из 2-4 аминокислот, вводят в реакцию конденсации для получения заданной последовательности аминокислот и конструкционную единицу, . включающую следующую последователь ность аминокислот формулы; i (CHzljCOOI iH-per-ASn-Leu-Ser-Trp-l HCHCoгде R - реактивный сложноэфирный остаток, вводят в реакцию образования кольца на любой стадии конструирования пептидной единицы; а защитную группу для реактивной группы удаляют на любой стадии реакции. Продукт может быть превращен в его соль присоединением кислоты или комплекс. Защитные згруппы для синтеза исходных материалов или промежуточных продуктов представляют собой обычные защитные группы, используемые при синтезе пептидов, и могут быть легко удалены путем гидролиза, кислотного разложения, восстановления, аминолиза или гидразинолиза. Предлагаемый полипептид может быть получен в виде свободного основания или в виде его соли. Свободное основание может быть обычным образом превращено в его соль. Свободное основание может быть превращено в его фармацевтически приемлемую соль при взаимодействии с неорганической кислотой, такой как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, или фосфорная кислота, или с органической кислотой, такой как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота, винная кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, низшая алкансульфокислота, бензолсульфокислота или толуолсульфокислота. В описании использованы следующие сокращения: ВОСгТрст-бутоксикарбонил CBZ: бензилоксикарбонил Bzl: бензил Biz(C22): дихлорбензил OEt: этиловый сложный эфир OBzI: бензиловый сложный эфир SertL серин LeurL лейцин Val:L валин ArgrL аргинин Ala:L аланин Lys:L лизин Clu:L глютаминовая кислота Tyr:L тирозин he: Ь-фенилалаНин ФК: трифторуксусная кислота ГА: циклогексиламин ГФ: тетрагидрофуран cOEt: этилацетат У5С:Н-этил -N-диметиламинопропилкародиимид ) ТСИ:Ы-оксисукцинимид МеОН: метанол AcOfl; уксусная кислота ГМФА: гексаметилфосфоротриамид ДОС:трет -амилоксикарбонил ClCbz: О-хлорбензилоксикарбонил Тог: тозил Ови;трет -бутиловый сложный эфир ONP:н -нитрофениловый сложный эфир OSu; fJ-оксисукцинилимидный сложный эфир Asn:L аспарагин TrpsL треонин PrO:L пролин AsptL а 5парагиновая кислота Gly; глицин Gln:L глютамин Hys:L гистида Met:L метйонив Jlu:L изолейцин TozOH: п-толуолсульфокислота ДЦГА: дициклогексиламин ДМФ; диметилформамид ДЦК: дициклогексилкарбодиимид ОБТ: 1-оксибензотриаэол EtOH: этанол БуОН: бутанол Пример. -(снг)5Г-eo-6ir-Asn-le«-$«r-Trp--NHCHCO-Het-L - &1у-Тгр-Тцг-тг р- §10 -AS р,- Phe-Asn-L y$ -Hij5-Trp- h е-Рг О-и 1 tv-тг Q-3ie-б1 у-Та : . -|С11 -А1й-ТгО--ЛН2- 2,0 г (0,6 мол 8ос-тгр (Bzg ) В2 е (се)(Bze )-G, -Лзр (ОВгг)-РЬе- Asn-L-ys cec&zJ-Pbe-H -Тгр(Bze)-P1ie - Pro-GEn- Trp (828/-ABo -aee- G,e:/-vae-eev-лец-Pro- wHg растворяют в 10 мл ТГФ. при - 5°С. Смесь перемешивают в течение 30 м при комнатной температуре, раство концентрируют в вакууме и продукт осаждают этилацетатом. Осадок суш над гидроокисью натрия, Сухой оса док растворяют в 10 мл диметилфор мамида и устанавливают рН 9 путем добавления триэтиламина при охлаж дении. К раствору прибавляют воду до образования осадка. Осадок суш на PrjOj, получают продукт в виде свободного основания, защищенного вое-группой 0,8г(0,71 моль) --(СН7), -CO-Cla-ASIbLeiJ-Ser(B2l)-Trp(Bzi)--NHCHC -hei-Ley-Gi -OH. растворяют в 5 мл смеси диметилформамида - N-метилпирролидон (1: К раствору прибавляют 122 мг OSu, затем при охлг1ждении 146 мг дицикогексилкарбодиимида, растворенного в 3 мл диметилформамида, смесь пеемешивают в течение ночи. Осадок отделяют и к раствору прибавляют сво-. бодное основание, полученное вьиае, прибавляют 100 мг 1-оксибензотриазола, смесь перемешивают в течение 5 дней при 30°С. По окончании реакции к смеси прибавляют воду. Отфильтровывают образовавшийся при этом осадок, промывают водой, сушат, получая 2,6 г. I;-{снг)5-I До-С.1у-А5П-1еи-5ег(В2:1ЬТГр(Вг ЬНЯСНСОЛе -1е11-С1у-тгр(Вг.1)-тдг- ВгиС1г))-СШ-А&р (OBz.lbPbe-ASr-LyS(ClCBz)-PheHHij5 -Тгр(вг1) -РЬе-Рго-clIv-тгp вгl -Ala-ale-й y-va 1-б ly-Ai Q-рго-БН 1 1,0 г сырого продукта обрабатывают 25 мл фтористого водорода, 0,1 г метионина и 2 мл анизола при -5°С в течение 60 мин при охлаждении смесью сухой лед - метанол, при пониженном давлении в присутствии .диметилтиоэфира. После отгонки фтористого водорода остаток промывают диэтиловым эфиром и собирают остаток декантацией, все это повторяют три раза, и растворяют в смеси: 30 мл уксусной кислоты и 10 мл воды. Затем раствор пропускают через колонку с Дауэкс 1x2, ацетатная форма (2,5-8 см), промывают 200 мл воды и снова пропускают элюат через колонку HP-20 (2,5x7 см). 80%-ный этанольный раствор пропускают через колонку и после перегонки элюата длй удаления этанола раствор лиофилизйруют, получая 440 мг порюшка. 440 мг этого порошка, растворенного в 0,01 М ;водном ацетате аммония, вливают в верхнюю часть колонки, наполненной СМ-целлюлозой (2,2x25 см) и элюируют с линейным градиентом элюирования 0,01-0,2 М ацетатом аммония (каждый 750 мл) (рН 4,5). Собирают каждые 10 г фракции и активные фракции .(фракции № 67-70) объединяют и сушат iвымораживанием для получения активного порошка. Лиофилизат растворяют в 1 М уксусной кислоте и хроматографируют на колонке с Сефадексом LH-20 (2,2x137 см), элюируя 1 М АсОН 6 г элюата, фракционируют, затем собирают активные фракции (№ 28-37 ) и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в верхнем .слое смеси бутанол: уксусная кислота: вода (4:1:5), и загружают раствор в колонку с Сефадексом G-25 (2,7х52сМ) который упаковывают в виде суспензии с нижним слоем указанной смеси

растворителей и после этого помещают в верхний слой указанной смеси растворителей. Элюирование проводят тем же верхним слоем, фракционируя каждые б г фракции, активные фракции (5-14-я трубки собирают и лиофлизируют. Полученный таким образом порошок повторно хромато1рафируют в тех же условиях на Сефадексе -6-2 и лиофилизируют. Лиофилизированный активный порошок растворяют в 1 М уксусной кислоте, выливают в колонку с Сефадексом LH-20 (2,2x137 см) элюируют 1 М уксусной кислотой на фракции по 5 г. Активные фракции объединяют и лиофилизируют, получают 29,7 мгпродукта (1000 MRCU /мг)

R 0,82 (носитель; Мерк целлюлоза, проявитель:н-бутанол:уксусная кислота:вода:пиридин 15:3:12:10).

Р 0,43 (носитель:Мерк целлюлоза, проявитель: н -бу.танол: уксусная кислота:вода (верхний слой) ).

toL 69,6 (С 0,72, 1 М уксусная кислота).

Аминокислотный анализ: Lys 1,15/1/, His 1,01/1/, Asp 2,94 /3/, Trp 4,80/5/, Ser l,0(5/l/r Glu 2,14/2/, Pro 1,96/2/, Gly 4,0/4/, Ala 2,00/2/, Val 0,95/1/. Met 0,87 /1/, Jie 0,96/1/, Leu 1,84/2/, Tyr 0,96/1/, Phe3,18/3/, а-аминспробкрвая кислота 1,02/1/.

Образец для аминокислотного анализа готовят следующим образом.

Предлагаемый полипептид гидролизуют 6 н.соляной кислотой (с добавлением нескольких капель анизола при 110 С в течение 45 ч и сушат при пониженном давлении. Осуществле радиоактивный иммунный анапиз чаловеческого кальцитонина с использованиеммеченого (Asu ) - анало человеческого кальцитонина,

Материалы и методы. Приготовлени антител. 180 мкг синтетического ( )-LCT (аналог человеческог кальцитонина ), растворенно:го в 1,0 м раствора соли, эмульгируют в полном стимуляторе Фрейнда (Кальбнокем) и вводят подкожно трем сашсам кролика (2,6-3,0 кг). Иммуни:шцию прослеживают посредством вспомогатель.ной инъекции на 2,4 и неделях. На 8-й неделе иммунизации от каждого кролика получают сыворотку, полученные образцы проверяют иа их способность связывать меченый аналог человеческого кальцитонина. Природный синтетический LCT (240325 мг) растворяют в 1 мл раствора соли, эмульгируют в полном стимуляторе и вводят подкожно пяти самкам кролика. Вспомогательную подкожную инъекцию осуществляют на 8 - 12-м месяце, а антитела проверяКТ на 10и 16-й неделях. Препараты антител LGT были поставлены 4-кальбиохем И применялись для сравнения. Используют козлиную стандартную сыворотку анти-у-глобулина кролика фирмы Эйкен Кемикал Ко, ЛТд.

Приготовление меченого LCT и аналога LCT. LCT и аналог LCT (2,55,0 мкг) метил (1,5-3,3 м Ки) по методу оксидазы глюкозы с лактопероксидазой. Выделение меченого пептида из солевого раствора осуществляют с помощью гель-фильтрации на колонке (0,8x25 см) с Сефадексом G-15, элюируют 1 н.уксусной кислотой. Меченые пептиды проверяют на химическую чистоту дополнительно гель-фильтрацией на Сефадексе G-50-(1,1x57 см /. Электрофорез на ацетате целлюлозы (2x10 см осуществляютпри постоянном напряжении 20 В/ом-(2 мА) в течение 510 мин, используя 0,01 М фосфатный буфер рН 7,4. Полученные после гельфильтрации меченые пептиды хранят при 4С в уксусной кислоте (1н.раствора), содержащей 5% альбумина бычьей сыворотки. Удельную активность рассчитывают по отношению радиоактивности пика пептида к радиоактивности пика соли, которую отделяют посредством электрофореза. Соль Na 1-коммерческий (Ассоциация Радиоизотопов, Япония).

Образец для культивирования. Типичное культивирование проводят в пластиковых пробирках (1x7 см) двухступенчатым методом двойной антителной методики. При начальном культивировании 0,.1 мл стандартного синтетического LCT для сыворотки и 0,1 мл анти-LCT антител при соответствующем разбавлении (обычно; 1:5000 добавляли к О,1 мя разбавителя, содержащего 0,037% динатриевой соли (Этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,5% альбумина бычьей сыворотки и 0,14 азида натрия в солевом растворе фосфатного буфера (0,01 М; рН 7, 0,15 М NaCl), Смеси культивируют при 4°С в течение 2 с и затем добавляют 0,1 мл LCT-аналога, достаточного для обеспечения 10000 срм Через 4 сут после начального культивиров ния добавляют 0,1 мл козлиной сыворотки анти- глобулина кролика (1:40) и 0,1мл 0,5%-ной обычной сыворотки кролика, и через 24ч реакционные смеси центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. Разбавление всех используемых для испытания материалов осуществляют с помощью разбавителя.

Предлагаемый образец испытан на активность по понижению кальция в

Сыворотке. Испытания проведены по следукхцей методике.

Образец адекватно разбавляют 0,1 и.раствором ацетата натрия -0,1% альбуминаг Самцам крыс индивидуально внутривенно вводят 0,2 NUI соответствующего разбавленного раствора. Через 1 ч всех крыс умерщвляют, собирают кровь и определяют содержание кальция в езывйрртке; в каждом образце крови с пснлоцью атомной абсорбдионйой с1яёК1Р1рофотометг-рии. - . :::. :

Сравнивая с соответствующим стандартом, определяют активность кальцитонина в образце.

На основании Проведенных испытаний установлено, что предлагаемое

соединение - (Asu - )LCT (аналог человеческого-капьцитонина) - обладает активностью (потенциал) 100 ед. MR, С/мг, в то время, как известное соединение - человеческий кальцитоНИН (LCT), имеет активность только 82 ед. MR, С/мг, т.е. предлагаемое соединение более чем в 10 раз активнее известного.

ПОЛИПЕПТИД формулы (СНг)51 -co-Ciy-Asn-Leu-Ser-Trp-BUCHCO-het-leu. -Giy i-Trp-Tjjf-Trp-ftiti-ASp-PW-Asn-L9$-Pbe -Hijs-Trt -Pl e-Pr0-6in-Trp- ia-3ie-eig oi- а1 }-А5а- Е ,- Quemam обладающий способностью снижать содержание кальция в сыворотке. (Л