Способ получения протеолитического фермента Советский патент 1985 года по МПК C12N9/68 C12N11/04 

Изобретение относится к получени ферментных препаратов и может быть применено в микробиологической промышленности, медицине, гематологии, физиологии и биохимии микроорганизмов, Известен способ получения протеа иммобилизованными в ПААГ клетками Streptomyces fradiae, заключающийся в том, что суспензию клеток в физиологическом растворе включают в 5%ный полиакриламидный гель с содержанием 10% сшивки (N,N -метиленбисакриламида) в течение 10 мин при 5°С и атмосфере газообразного азота Гель с включенными в него клетками разрезают на небольшие блоки (2-3 мм) и обрабатывают реакционной средой (0,5% крахмала, 0,5% мясного экстра та, 0,05% дрожжевого зкстракта, 0,02% , 0,01% MgSO. 7HjO) три раза по 2 ч; Для повышения выхода фермента гранулы с клетками обрабатывают 75%-ным этанолом и использую до 30 раз 1. Однако этот способ неэкономичен вследствие получения фермента иммобипизованными клетками на дорогосто ящей реакционной среде, содержащей 0,5% крахмала, 0,5% мясного экстрак та и 0,05% дрожжевого зкстракта, трудоемок вследствие проведения дополнительной обработки .гранул реакционной средой и этанолом, достаточно длителен и у целевого продукта отсутствует фибринолитическая ак тивность. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения протеолитического фермента фибринолитического действия, которы предусматривает использование проак тиномицетов (в частности, Nocardia sp.1) в качестве продуцентов фибринолитических (фибрин - основная составная часть тромба) ферментов. Продуцент выращивают на посевной среде (МПБ+3% глюкозы) в течение 3 сут, а затем на ферментационной среде (синтетическая среда СР-1) также 3 сут отделяют клетки, а из культуральной жидкости с помощью сернокислого аммония высаливают фер .мент с последующим диализом и лиофильным высушиванием 2. Однако известный способ обладает недостаточно высоким выходом целево продукта и невысокой скоростью его получения. Кроме того, способ неэкономичен вследствие необходимости многократного выращивания посевного материала и длительности процесса и трудоемок. Цель изобретения - упрощение процесса и увеличение выхода целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения протеолитического фермента, заключающемуся в выращивании продуцента Nocardia sp.1 на среде мясо-пептон- ного бульона с 3%-гным содержанием глюкозы с последующим перенесением на синтетическую среду СР-1, инкубацией и высаливанием фермента сернокислым аммонирм из культуральной жидкости, после инкубации суспензию клеток продуцента смешивают с реагентом, вызывающим процесс гелеобра- зования, до достижения содержания биомассы в реагенте 0,1-3,0%, затем в полученную смесь вводят.инициатор гелеобразования, смесь инкубируют в течение 2-30 мин при 12-20 С, затем гель или его пленку фрагментируют на гранулы размером 0,5-1,5 мм и инкубир тот на синтетической среде СР-1 в течение 20-24 ч при 2830 С, после чего отделяют культуральную жидкость от гранул и осаждают из нее целевой продукт. В качестве реагента, вызывающего процесс гелеобразования, используют 4%-ный раствор альгината натрия, перекристаллизованный акриламид и 10%-ный раствор поливинилового спирта. В качестве инициатора гелеобразования используют О,1 М раствор СаСг,N,N -метиленбисакриламида и облучение ультрафиолетовыми лучами. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. В среду МПБ с 3%-ньм содержанием глюкозы вносят смыв клеток Nocardia sp,1 с агаризованной среды этого же состава и культивируют 48 ч, после чего проводят процесс гелеобразования с участием инициатора гелеобразования, смесь инкубируют в течение 2-30 мин при 12-20°С, затем гель Или его пленку фрагментируют на гранулы размером 0,5-1,5 мм и инкубируют на синтетической среде СР-1 в течение 20-24 ч при 28-30 С, после чего отделяют культуральную жидкость от гранул и осаждают из нее целевой продукт. Предлагаемый способ является более упрощенным, так как не содержит операций обработки альгината натрия карбонатом магния, обработки включе ных в ПААГ клеток реакционной средой и этанолом, насьпцения полимеризуемой смеси газообразным азотом. Прим ер 1. В среду М11Д+3% глюкозы вносят смыв клеток Nocardia sp.1 с агаризованной среды этого же состава, культивируют 48 ч при 2830°С в колбах .на 750 мл со tOO мл среды на круговых качалках (220 об/мин), после чего клетки с культуральной жнцкостью (10 мл) сме шивают с 4%-ным раствором альгината натрия (10 мл) на дистиллированной воде. Смесь вносят по каплям (диаметр отверстия 1 мм) с помощью пипетки в 0,1 М раствор при ком натной температуре. Образовавшиеся шарики геля диаметром 1,5 мм оставляют в растворе хлорида кальция при с на 1-2 ч для стабилизации. 20 мл гранул с клетками помещают в колбу на 250 мл, содержащую 50 мл среды СР-1 с 0,05 М , , и инкубирзпот при 28-30 С на круговой качалке (220 об/мин). Через 20 ч куль туральную жидкость сливают с гранул промывают их физиологическим раство ром к запивают 50 мл свежей среды СР-1 с 0,05 М СаСе Из полученной .культуральной жидкости фермент осаж дают сернокислым аммонием при насыщении 0,6-0,8, Биосинтез фермента на синтетической среде СР-1 с помощью иммобилизованных в Са-альгинатный гель клеток продуцента повторяют мно гократно. Получают суммарный выход целевого продукта 13100 усл.ед./мл. Пример 2. Клетки продуцента, вьфащенные на МПБ+3% глюкозы, как в примере 1, отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин. Клеточную суспензию в физиологическо растворе включают в 10% ПААГ с 5%Hbw содержанием сшивающего агента К,Н-метиленбисакриламида (МБА). Для этого к 11 мл водного раствора, содержащего 1,9 г перекристаллизован ного акриламида (ЛА) и 0,1 г МБА, добавляют 6 мл клеточной суспензии. 574 содержащей 600 мг биомассы, 3 мл 1%-ного водного раствора персульфата аммония и 0,4 мл К,№,к ,Н-теграметилэтилендиамина (ТЕМЭД). Полимеризацию ведут при 12-14°С в течение 2-4 мин. Полученный блок геля механически фра1ментируют пр од а вливанием через сито. Гранулы размером 0,5 мм многократно промывают декантацией физиологическим раствором для удаления невключающихся в гель клеток и остатков компонентов полимеризационной смеси, 20 мл гранул с клетками используют для биосинтеза фермента на среде СР-1, как описано в примере 1. Суммарный выход целевого продзпста составляет 28764 уел,ед./мл. ПримерЗ. 10%-ный раствор поливинилового спирта в дистиллированной воде нагревают на водяной бане до полного растворения, 10 мл охлажденного ПВС перемешивают с суспензией клеток, содержащей 150200 мг биомассы, полученной, как в примере 1, и отделенной от культуральной жидкости центрифугированием, как в примере 2. Осмесь выливают в чашку Петри (диаметр 10,5 см, слой 0,5 мм) и облучают 5-15 мин ультрафиолетовыми лучами (кварцевая лампа ПРК) при комнатной температуре. Полученнзто пленку высушивают 1,5-3,0 сут, фрагментируют на кусочки размером около 1 мм. Перед фрагментацией вожможно также выдерживание пленки с клетками 9 сут при 4 С для повьппения ферментативной активности иммобилизованных в ПВС клеток продуцента. Измельченную пленку геля с клетками помещают в колбу на 250 мл с 50 мл среды СР-1 и инкубирают 24 ч при 28-30с на качалке (220 об/мин). Затем культуральную жидкость отеляют декантацией, вьщеляют из нее ермент, как в примере 1. Гель с летками промывают физиологическим аствором и заливают свежей средой Р-1. Эти процедуры многократно поторяют. Получают суммарный выход цеевого продукта 30030 усл.ед./мл. Сравнительные данные результатов пытов по известному и предлагаемому пособам представлены в таблице, Из данных, приведенных и таблие, вццно, что суммарный выход фермента при использовании иммобилизованных клеток нокардии возрастает в 6-14,5 раз, а скорость синтеза ; фермента - в 3,5-3,9 раза по сравне нию с известным способом (свободные клетки). В предлагаемом способе происходит не только ускорение и увеличение выхода фермента, но и возрастание экономичности способа в силу того, что культзфу продуцента вщ ащивают один раз, а весь осталь157057

,ной процесс проводят на этих же, закрепленных в геле, клетках, меняя ежедневно ферментационную среду определенного состава. Использование (Иммобилизованных клеток повьппает экономичность и дает возможность сократить время, затрачиваемое на биосинтез фермента, в 2-3 раза и облегчает очистку, так как сразу получают раствор фермента, свободный от клеток продуцента.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕО ЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА, заключающийся в выращивании продуцента Nocardia sp.1 на среде мясопептонного бульона с 3%-ным содержанием глюкозы с последующим перенесением на синтетическую среду СР-1, инкубацией и высаливанием фермента сернокисльп : аммонием из культуральной жидкости, о тли чающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, после инкубация суспензию клеток продудента смешивают с реагентом, вызывающим процесс гелеобразования, до достижения содержания биомассы в реагенте 0,1-3,0%, затем в полученную смесь вводят инициатор гелеобразования, смесь инкубируют в течение 230 мин при 12-20°С, затем гель или его пленку фрагментируют на гранулы .размером 0,5-1,5 мм и инкубируют на синтетической среде СР-1 в течение 20-24 ч при 28-30 С, после чего отделяют культуральную жидкость от гранул и осаждают из нее целевой продукт. 2.Способ по П.1, отличающийся тем, что в качестве реагента, вызьгоающего процесс гелеобразования, используют 4%-ный раствор альгината натрия, перекристаллиз6ванный акриламнц и 10%-ный раствор поливинилового спирта. 3.Способ по П.1, о тлич ающ и и с я тем, что в качестве иници.атора гелеобразования используют сл 0,1 М раствор CaCfcf,N,N-метиленбис о сл акрштамида и облучение ультрафиолетовыми лучами. 1

Свободные клетки Nocardia sp.1

Клетки Nocardia sp.1 иммобилизирOBаны

28,9

100

100