Способ получения тромболитических ферментов специфичных к фибрину Советский патент 1982 года по МПК C12N9/68 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТГОМБОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ФИБРИНУ

1

Изобретение относится к получению ферментных препаратов и может быть применено в медицине, микробиологической промышленности, гематологии и биохимии микроорганизмон.

Известен способ получения протеаз фибринолитического, казеинолитического и тромболитического действия путем совместного культивировани двух микроорганизмов одного рода, но разных видов: Aspergillus kanagawaensis - продуцента протеаз и Aspergillus wentii - неак- JQ тивного в отношении образования секретируемых протеаз организма, которые вносят в равных количествах в питательную среду: A.kana- gawaensis - в виде-посевного материала, а А. wentii -в виде вегетативного материала, ,5 инкубируют, отдегяют клетки и из культуральной жидкости выделяют целевой продукт 11.

Недостатками способа являются необходимость получения для Aspergillus wentii не только двухсутошого посевного материала, 20 на трехсуточного вегетативного, что значительно (на 3 сут) удлиняет процесс получения нелепого продукта (7-8 сут). кроме того, невысокий выход нелевого продукта и снижение у делевого продукта специфичности к фибрину.

Известен способ получения нротеолитических ферментов казеинолитического и фибринолитического действия, предусматриваюший совметное культивирование при 28-30° С микроорганизма - продуцента и микроорганизма - стимулятора, не синтезирующего протеа:з, последуюшее отделение клеток и высаливание целевого продукта сернокислым аммонием при насыщении 0,6-0,8, в котором в качестве продуцента используют Actinomyces rimosus, в качестве микроорганизма - стимулятора Actinomyces violaceus, а посевной материал обоих штаммов вносят в среду в соотношении 0,25:1 соответственно 2.

Недостатками способа (прототипа) являются длительность способа (6 сут), многокомпонентность состава среды и наличие в ней дефицитных и дорогостоящих реактивов, невысокий выход целевого продукта (фибринолитическая активность 1901 ед/мл, казеинолнтическая активность 156 ед/мл), а также низкая специфичность к фибрину у целевого продукта (33,9). 3973 Цель изобретения - ускорение процесса куль тивирова1шя, увеличение фибринолитической активности и повышение специфичности ферментного препарата к фибрину. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения тромболитических ферментов специфичных к фибрину, предусматри вающему совместное культивирование при 28- 30° С микроорганизма - продуцента и микроорганизма - стимулятора, не синтезирующего протеаз, последующее отделение клеток и высаливание целевого продукта сернокислым аммонием при насыщении 0,6-0,8, в качестве продуцента используют Nocardia species, цггамм 1, в качестве микроорганизма - стимулятора Arthro bacter citreus, штамм В-654, посевной материал обоих щтаммов вносят в питательную среду в соотношении 1:0,5-1; 0,25 соответственно, а культивирование осуществляют в течение 7072 ч. Штамм В-654 Arthrobacter citreus хранится о под этим номером во всесоюзной коллекции микроорганизмов АН СССР (Институт физиологии и биохимии микроорганизмов АИ СССР). Пример 1.В известную синтетическую среду СР-1 (глюкоза 2%, KNOs 0,1%, К2НРО4 0,005%, MgS040,05%,NaC1 0,05%, CaCOj 0,1%, FeSO4 0,001%)после стерилизации вносят 5% по объему жидкого двухсуточного посевного материала Nocardia species штамм 1 и 2,5% по объему жидкого двухсуточного посевного. материала Arthrobacter citreus штамм В-654, выращенного на среде МПБ+3% глюкозы. Культивирование смешанной культуры осуществляют глубш ным способом в колбах на 750 мл со 100 мл среды на качалках (220 об/мин) при 28° С в течение 72 ч. По истечении этого времени культуральная жидкость содержит 3456 усл. ед/мл фибринолитической акти&рости 14,3 каз. ед/мл казеинолитической активности и растворяет тромбы за 1,5 ч. Для выделения фермента клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием и проводят высаливание ферментов сернокислым аммонием при насыщении 0,6 в течение 48 ч при 4°С. Выпавший осадок растворяют в воде, диализуют 24 ч при 4 С против 0,002 М ацетата кальция и лиофильно высушивают. Выделенный препарат обладает специфичной активностью в 16500 ед/мг белка. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в смешанной культуре микроорганизмов по предлагаемому способу происходит образование протеаз с казеинолитическим действием на 28,8, фибринолитическим действием на 80% и тромболитическим действием на 50% больше, чем в чистой культуре Nocardia species штамм 1. Увеличение ферментативной активности сопровождается возрастанием специфичности ферментов к фибрину (в 7 раз по сравнению с прототипом). Пример 2. В известную синтетическую среду СР-1 (состав среды приведен) после стерилизации вносят 5% по объему жидкого двухсутошого посевного материала Nocardia species щтамм 1 и 1,25% по объему жидкого двухсуточного посевного материала Arthro- bacter citreus щтамм В-654, выращенного на среде МПБ+3% глюкозы. Культивирование смешанной культуры осуществляют глубиннь1М способом в колбах на 750 мл со 100 мл среды на качалках (280 об/мин) при 30° С в течение 70 ч. По истечении этого времени культуральная жидкость содержит 3280 усл. ед/млфибринолитической активности, 14,1 каз. ед/мл казеинолитической активности и растворяет тромбы за 1,6 ч. Для вьщеления фермента клетки отделяют от культуральной. .з идкости центрифугированием и проводят высаливание ферментов сернокислым аммонием при насыщении 0,8 в течение 48 ч при 4°С. Выпавший осадок растворяют в воде, диализуют 24 ч при 4° С против 0,002 М ацетата кальция и лиофильно высушивают. Полученный препарат обладает специфичной активностью в 16450 ед/мг белка. В таблице представлена сравнительная характеристика ферментных препаратов, получен ных по способу прототипу и предлагаемому способу. Поскольку в совместной культуре казеинолиз возрастает всего на 28,8% , фибринолиз на 80%,то резко (2-7 раз) увеличивается специфичность получаемых протеаз к фибрину. Наличие у целевого продукта высокой специфичности к фибрину имеет большое практическое значение, так как именно это свойство обеспечивает при. действии фермента in vivo возможность растворять тромбы крови без гидролиза других жизненно важных белков крови, т. е. без гемофилии, которая представляет такую же опасность для жизни чело,века как и тормбоз. Таким образом, реализация изобретения позволяет сократить время культивирования продуцента, увеличить фибринолитическую активность и повысить специфичность целевого продукта к фибрину.

Прототип Act. rimosus

+ Act. viofaceus

Предлагаемый способ Контроль Nocardia species/

. Опыт Nocardia species/

+

Arthrobacter crtreus В 654

Формула изобретения

Способ получения тромболитических фермен- 30 тов, специфичных, к фибрину, предусматривающий совместное культивирование при 28-30°С микроорганизма продуцента и микроорганизма- cnfMynHTOpa, не синтезирующего протеаз, последующее отделение клеток и высаливание 5 целевого продук{а сернокислым аммонием при насыщении 0,6-0,8, отличающийс я тем, что, с целью ускорения процесса культивирования, увеличения фибринолитическ ж активности и повьпиения специфичности фер- м ментного препарата к фибрину, в качестве

56 100

33,9

11,1 100

100

172,9

180 14,3 128,8

1,5 50

продуцента используют Nocardia species, штамм 1, в качестве микроорганизма - стимулятора

Arthrobacter citreus, штамм В-654, посевной материал обоих штаммов вносят в га1татель ную срецу в соотношении 1:0,5-1:0,25, соответственно, а культивирование осуществляют в течение 70-72 ч.

Источники инфс мацни, принятые во внимание при экспертзе

2.Авторское свидетельство СССР № 436086, кл. С 12 N 9/48, 1972 (прототип).